甜葉菊綠原酸對(duì)蛋雛雞血清免疫和盲腸菌群的影響

■卓春柳 王方方 石玉祥

（河北工程大學(xué)，河北邯鄲056107）

自20世紀(jì)60年代以來，全球畜牧業(yè)生產(chǎn)大幅增長(zhǎng)，這是世界人口增長(zhǎng)和糧食需求增加的直接后果[1]?？股卦谛竽翗I(yè)發(fā)揮了重要作用，抗生素不僅可以預(yù)防、控制和治療動(dòng)物疾病，還可用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑增加畜牧業(yè)產(chǎn)值。然而，其過度使用導(dǎo)致了動(dòng)物微生物種群抗生素耐藥性，抗生素濫用及大量耐藥菌出現(xiàn)引起全球公共衛(wèi)生關(guān)注[1-2]。許多國(guó)家開始禁止在動(dòng)物飼料中使用抗生素：1986年瑞典禁止在動(dòng)物飼料中添加抗生素；2006年歐盟禁止在豬生產(chǎn)中使用抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑，預(yù)計(jì)未來幾年將有467個(gè)國(guó)家加入禁抗行列[3]；2001年我國(guó)公布168號(hào)公告，提出可使用的飼料添加劑只有33種，2019年發(fā)布征求意見稿提出“除中藥外藥物添加劑退出市場(chǎng)”。動(dòng)物飼料中禁止使用抗生素不僅導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)量下降，同時(shí)會(huì)增加消費(fèi)者食源性感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)具有成本效益的抗生素替代品是最大的挑戰(zhàn)，對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)的長(zhǎng)期可持續(xù)性和盈利能力至關(guān)重要。當(dāng)前抗生素代替品需具有安全無污染、機(jī)體易吸收、不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)[4]。藥食同源的天然植物儼然已成為未來畜牧業(yè)發(fā)展的方向[5]。研究報(bào)道杜仲具有極高藥用價(jià)值，其提取物中富含綠原酸、黃酮、木脂素等藥理成分，其中綠原酸具有廣泛抗炎抑菌，可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、減少促炎細(xì)胞因子分泌、抑制病毒感染等[6]。綠原酸(Chlorogenic acid,CGA)不僅在杜仲中含量豐富[7]，還可從咖啡豆[8]、水果、蔬菜[9]、菊科[10]及忍冬科等多種植物中提取出來。研究報(bào)道甜葉菊提取物具有抗炎抑菌、抗癌抗氧化、降血糖血脂等極高藥理特性，甜葉菊中總咖啡?？鼘幩岷窟_(dá)3.28%，雙咖啡?？鼘幩岷空?.65%[11]，其水提物及絮凝上清液中除甜菊糖苷外還含有多種綠原酸類和黃酮類藥理成分。CGA作為一種功能性膳食多酚類物質(zhì)，不僅來源廣泛、綠色健康、無污染和不易產(chǎn)生耐藥性，且具有抗炎抑菌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物功能[12-15]，在近幾年基礎(chǔ)和臨床研究中都提到了攝入CGA后有降低各種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，可替代抗生素和激素類藥物成為理想飼料添加劑，在動(dòng)物養(yǎng)殖中具有廣泛應(yīng)用前景，符合綠色添加劑開發(fā)趨勢(shì)。當(dāng)前關(guān)于甜葉菊中綠原酸提取物在動(dòng)物上的研究極少，大多研究試驗(yàn)材料所用的綠原酸主要來源于杜仲[16]、金銀花[17]和菊花[18]等，本試驗(yàn)所用綠原酸提取自甜葉菊（提取自甜菊糖苷后所剩殘?jiān)?；另外目前大部分研究?bào)道為CGA對(duì)魚[19]、斷奶仔豬[4，20-22]和鼠[14，23]的影響，對(duì)蛋雛雞相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究則將甜葉菊綠原酸作為試驗(yàn)材料，研究甜葉菊綠原酸對(duì)蛋雛雞腸道菌群和血清免疫指標(biāo)的影響。綠原酸主要通過提高機(jī)體自身免疫力，改善腸道微生物區(qū)系，影響腸道菌群平衡促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。因此本試驗(yàn)以蛋雛雞為研究對(duì)象，采用ELISA、盲腸內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)法，檢測(cè)分析蛋雛雞免疫力和盲腸菌群變化，初步篩選甜葉菊綠原酸合適作用劑量，為綠原酸作為蛋雛雞新型抗生素替代品應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

甜葉菊綠原酸（綠原酸純度60%，其余主要為糖苷類物質(zhì)）和杜仲提取物（綠原酸純度8%，其余主要為杜仲黃酮和杜仲多糖）均由晨光生物科技集團(tuán)提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選擇1日齡健康海蘭蛋雞300只，隨機(jī)分為5組，分組情況見表1，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只雞，公母各半。預(yù)試期7 d后開始試驗(yàn)，7、14日齡和21日齡時(shí)按表1分別向試驗(yàn)組蛋雛雞的飲水中添加不同藥物，每日1次，連用5 d。按飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)管理，試驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2，試驗(yàn)周期25 d，飼養(yǎng)試驗(yàn)于2019年在河北省邯鄲市河北工程大學(xué)生命學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行。

表1 試驗(yàn)分組

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 ELISA檢測(cè)血清免疫相關(guān)指標(biāo)

血清樣品的制備：分別在第5次飼喂綠原酸90 min后，每組取3只雞，心臟取血，5 000 r/min離心5 min，取上清液并分裝，獲得血清樣品，于-20℃冰箱凍存待測(cè)。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒（南京建成生物有限公司）說明書檢測(cè)血清IL-1β和IL-2水平。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)甜葉菊綠原酸對(duì)蛋雛雞盲腸菌群的影響

盲腸內(nèi)容物樣品的采集：分別在第5次飼喂綠原酸90 min后，每組取3只雞，取盲腸食糜內(nèi)容物，用于平板菌落計(jì)數(shù)，具體操作如下：

將1 g盲腸內(nèi)容物置于燒杯中，加入9 mL生理鹽水?dāng)嚢杈鶆蚝?，吸?00μL于含有900μL生理鹽水的EP管中充分搖勻，進(jìn)行10倍系列稀釋。倒入培養(yǎng)基搖勻，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行盲腸菌落總數(shù)計(jì)數(shù)，MRS培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基進(jìn)行腸桿菌計(jì)數(shù)，BBL培養(yǎng)基進(jìn)行雙歧桿菌計(jì)數(shù)，LBS培養(yǎng)基進(jìn)行乳桿菌計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行處理分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析，有不同字母標(biāo)注表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜葉菊綠原酸對(duì)蛋雛雞血清免疫指標(biāo)的影響(見表3)

表3 飼喂甜葉菊綠原酸的蛋雛雞血清免疫指標(biāo)變化（ng/L）

由表3可知，7日齡開始飼喂：與空白對(duì)照Ⅰ組相比，添加杜仲和甜葉菊綠原酸對(duì)蛋雛雞血清IL-1β均無顯著影響（P＞0.05）；與陽性對(duì)照組Ⅱ組相比，Ⅳ可顯著降低蛋雛雞血清IL-1β、IL-2含量（P＜0.05），其余組均無顯著影響（P＞0.05）。14日齡開始飼喂：與空白對(duì)照Ⅰ組相比，添加杜仲和甜葉菊綠原酸對(duì)蛋雛雞血清IL-1β、IL-2均無顯著影響（P＞0.05）；與陽性對(duì)照組Ⅱ組相比，甜葉菊綠原酸組均無顯著影響（P＞0.05）。21日齡開始飼喂：與空白對(duì)照Ⅰ組相比，添加杜仲和甜葉菊綠原酸對(duì)蛋雛雞血清IL-1β、IL-2有降低趨勢(shì)，其中Ⅱ組和Ⅴ組蛋雛雞血清IL-1β顯著降低（P＜0.05），Ⅴ組蛋雛雞血清IL-2顯著降低（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組Ⅱ組相比，甜葉菊綠原酸組對(duì)IL-1β無顯著影響，Ⅴ組蛋雛雞血清IL-2顯著降低（P＜0.05）。

2.2 甜葉菊綠原酸對(duì)蛋雛雞盲腸菌群的影響

2.2.1 7日齡時(shí)飼喂甜葉菊綠原酸的蛋雛雞盲腸菌落計(jì)數(shù)結(jié)果(見表4)

表4 7日齡時(shí)飼喂甜葉菊綠原酸的蛋雛雞盲腸菌落計(jì)數(shù)結(jié)果[Lg(CFU/mL)]

由表4可知，與對(duì)照組和杜仲組相比，盲腸細(xì)菌總數(shù)均有下降，其中Ⅲ、Ⅴ組均顯著下降（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ組可顯著降低盲腸腸桿菌數(shù)量（P＜0.05）；盲腸乳酸菌數(shù)量有上升趨勢(shì)，其中Ⅲ、Ⅴ組顯著升高（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅴ組均可顯著升高盲腸乳桿菌數(shù)量（P＜0.05）；Ⅳ、Ⅴ可顯著升高盲腸雙歧桿菌數(shù)量（P＜0.05）。

2.2.2 14日齡時(shí)飼喂甜葉菊綠原酸的蛋雛雞盲腸菌落計(jì)數(shù)結(jié)果(見表5)

由表5可知，與對(duì)照組和杜仲組相比，甜葉菊綠原酸（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組）盲腸細(xì)菌總數(shù)均有下降；Ⅴ組盲腸腸桿菌數(shù)量顯著升高（P＜0.05）；甜葉菊綠原酸添加組盲腸乳酸菌、乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均顯著升高（P＜0.05）。

表5 14日齡時(shí)飼喂甜葉菊綠原酸的蛋雛雞盲腸菌落計(jì)數(shù)結(jié)果[Lg(CFU/mL)]

2.2.3 21日齡時(shí)飼喂甜葉菊綠原酸的蛋雛雞盲腸菌落計(jì)數(shù)結(jié)果(見表6)

由表6可知，與對(duì)照組和杜仲組相比，Ⅳ、Ⅴ均可顯著降低盲腸腸桿菌數(shù)量（P＜0.05）；甜葉菊綠原酸對(duì)盲腸乳酸菌、乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量影響不顯著（P＞0.05）。

表6 21日齡時(shí)飼喂甜葉菊綠原酸的蛋雛雞盲腸菌落計(jì)數(shù)結(jié)果[Lg(CFU/mL)]

3 討論

3.1 甜葉菊綠原酸對(duì)蛋雛雞血清免疫指標(biāo)的影響

機(jī)體免疫機(jī)能的穩(wěn)定對(duì)雛雞正常生長(zhǎng)具有重要影響，綠原酸可以通過抑制免疫細(xì)胞和免疫因子并活化免疫抑制因子等一系列抗炎反應(yīng)，激活宿主細(xì)胞免疫及體液免疫進(jìn)而增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫保護(hù)功能。當(dāng)前關(guān)于綠原酸和杜仲提取物對(duì)蛋雛雞血清免疫生化指標(biāo)的影響研究未見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)綠原酸可提高小鼠IL-2和TNF-γ等免疫因子的表達(dá)水平，升高斷奶仔豬空腸黏膜中TNF-α轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量[22]，降低斷奶仔豬血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量，提高血清IgG含量[21]。另外杜仲提取物對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫力同樣具有促進(jìn)作用。研究報(bào)道杜仲葉提取物可不同程度提高肉兔血清中IgA含量[24]，有效改善黃羽肉雞免疫功能[25]，提高斷奶仔豬血清總抗氧化能力及血清白蛋白和總蛋白含量(P＜0.05)[26]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示7日齡開始投服甜葉菊綠原酸和杜仲提取物對(duì)蛋雛雞血清IL-1β、IL-2有提高趨勢(shì)；14日齡開始投服，無顯著影響；但21日齡開始投服，對(duì)蛋雛雞血清IL-1β、IL-2有降低趨勢(shì)，其中4 g/L甜葉菊綠原酸Ⅳ組可顯著降低蛋雛雞血清IL-1β和IL-2含量（P＜0.05）。IL-1β、IL-2等血清炎性細(xì)胞因子含量在一定范圍升高有助于增強(qiáng)雛雞免疫力，雛雞處于炎癥狀態(tài)血清炎性細(xì)胞因子含量會(huì)有所升高，以用于抵抗炎性損傷。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蛋雛雞7日齡和21日齡飼喂藥物均具有顯著影響，7日齡蛋雛雞血清免疫細(xì)胞因子含量有升高趨勢(shì)，而21日齡蛋雛雞血清免疫細(xì)胞因子含量有降低趨勢(shì)，另外試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)在21日齡飼喂綠原酸和杜仲時(shí)，蛋雛雞均會(huì)有腹瀉現(xiàn)象，而空白對(duì)照組均無，推測(cè)21日齡投服藥物可能導(dǎo)致雛雞發(fā)生炎性損傷，這可能與此時(shí)腸道菌群狀態(tài)紊亂有關(guān)。因此后期試驗(yàn)可以選擇于蛋雛雞7日齡進(jìn)行較合適。

3.2 甜葉菊綠原酸對(duì)蛋雛雞盲腸菌群的影響

腸道作為消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所，其腸道黏膜及結(jié)構(gòu)的完整性、腸道微生物菌群的正常狀態(tài)決定著腸道的正常吸收功能。研究報(bào)道綠原酸可以增加動(dòng)物結(jié)腸微生物區(qū)系的多樣性[27]，增加斷奶仔豬結(jié)腸乳桿菌數(shù)量并降低大腸桿菌數(shù)量[28]。杜仲提取物同樣也可促進(jìn)動(dòng)物腸道微生物穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)杜仲提取物可增高小鼠厚壁桿菌門和變形菌門相對(duì)豐度，降低擬桿菌門相對(duì)豐度下降[29]，改善虹鱒腸道菌群結(jié)構(gòu)[30]，顯著降低肥育豬其腹瀉率，調(diào)節(jié)肥育豬腸道菌群[31]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示7日齡開始投服，綠原酸不僅影響腸桿菌，還相應(yīng)提高益生菌的數(shù)量，其中2 g/L甜葉菊綠原酸添加組Ⅳ組可顯著降低盲腸腸桿菌數(shù)量（P＜0.05），提高盲腸益生菌數(shù)量（P＞0.05）；相對(duì)于杜仲提取物添加組，綠原酸調(diào)節(jié)益生菌的效果更好。而14日齡和21日齡開始投服，綠原酸調(diào)節(jié)腸道菌群的效果和杜仲提取物相近，這與前人研究結(jié)果一致。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)在21日齡飼喂綠原酸和杜仲提取物，蛋雛雞均會(huì)出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，推測(cè)此時(shí)出現(xiàn)的腹瀉現(xiàn)象可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。李永洙[32]對(duì)不同日齡（4、6、10、16、20和40日齡）蛋雞盲腸內(nèi)容物的細(xì)菌群落進(jìn)行特異性引物圖譜指紋和聚類分析，發(fā)現(xiàn)蛋雞群各飼養(yǎng)階段盲腸細(xì)菌群落差異顯著，對(duì)雞群正常生長(zhǎng)發(fā)育影響較大。研究發(fā)現(xiàn)SPF雞從孵化到84日齡正常腸道菌群發(fā)育存在明顯差異，盲腸上存在大量兼性和嚴(yán)格厭氧菌，從第3 d可分離出顯著水平鏈球菌和大腸菌群；前40 d以糞便鏈球菌和大腸菌群為主，后以乳酸菌為主；40 d后，菌群逐漸穩(wěn)定，主要由糞便鏈球菌、大腸桿菌、擬桿菌和乳酸菌組成。雞在不同日齡段（3～7日齡、14～28日齡）盲腸菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，在21日齡左右盲腸優(yōu)勢(shì)菌正在發(fā)生變化，在飼喂綠原酸和杜仲后，可能會(huì)造成腸道菌群紊亂，從而出現(xiàn)群體腹瀉現(xiàn)象。因此后期試驗(yàn)應(yīng)選擇蛋雛雞7日齡飼喂2 g/L甜葉菊綠原酸。

4 結(jié)論

從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在蛋雛雞7日齡時(shí)開始添加2 g/L甜葉菊綠原酸后可明顯調(diào)節(jié)蛋雛雞腸道菌群平衡，增強(qiáng)蛋雛雞免疫功能。