綠硫細(xì)菌光合反應(yīng)中心復(fù)合體的原子結(jié)構(gòu)

陳景華，匡廷云，沈建仁?，張興???

①浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院生物物理系，邵逸夫醫(yī)院，冷凍電鏡中心，杭州 310058；②中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京100093

1 光合細(xì)菌反應(yīng)中心簡(jiǎn)介

1.1 光合反應(yīng)中心定義與分類(lèi)

光合作用是指光合生物利用光能將無(wú)機(jī)物轉(zhuǎn)化為有機(jī)物，同時(shí)產(chǎn)生氧氣(或生成硫單質(zhì))的生化反應(yīng)過(guò)程。光合作用為幾乎所有生物的生存繁衍提供必需的物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來(lái)源，被稱(chēng)為“地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)”。反應(yīng)中心是光合作用過(guò)程中進(jìn)行光能-電能轉(zhuǎn)化的核心結(jié)構(gòu)，是具有特殊空間構(gòu)造的色素-蛋白復(fù)合體。通常根據(jù)末端電子受體的種類(lèi)可以將反應(yīng)中心分為兩類(lèi)，即鐵-硫型反應(yīng)中心(type-I型)和醌型反應(yīng)中心(type-II型)[1]。已知的產(chǎn)氧光合生物(如藍(lán)細(xì)菌、綠藻和高等植物)均具有兩類(lèi)反應(yīng)中心，分別又稱(chēng)為光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II；而非產(chǎn)氧光合生物(絕大多數(shù)光合細(xì)菌)僅具有單一類(lèi)型的反應(yīng)中心。

1.2 光合細(xì)菌的分布

光合細(xì)菌是地球上分布最廣、種類(lèi)最多的光合生物。已報(bào)道的光合細(xì)菌主要分布在7個(gè)菌門(mén)，即厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、綠菌門(mén)(Chlorobi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)和藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)[2]。不同菌門(mén)的代表性光合細(xì)菌在反應(yīng)中心類(lèi)型、蛋白亞基及色素組成上存在較大差異(表1)。由表1可見(jiàn)，這些光合細(xì)菌中，除藍(lán)細(xì)菌是產(chǎn)氧生物，具有兩類(lèi)反應(yīng)中心外，其余都是非產(chǎn)氧細(xì)菌，僅具有單一類(lèi)型的反應(yīng)中心。

表1 光合細(xì)菌所屬的菌門(mén)及各代表性菌種反應(yīng)中心類(lèi)型與色素組成[2]

1.3 光合細(xì)菌反應(yīng)中心的進(jìn)化研究

1985年，科學(xué)家Hartmut Michel、Robert Huber和Johann Deisenhofer解析了紫細(xì)菌(變形菌門(mén))光合反應(yīng)中心的原子結(jié)構(gòu) (世界上第一個(gè)膜蛋白晶體結(jié)構(gòu))，因此榮獲1988年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[3]。此后，除綠菌門(mén)和酸桿菌門(mén)外，已知的光合細(xì)菌的反應(yīng)中心空間結(jié)構(gòu)均先后被解析[4-13]。研究人員通過(guò)對(duì)比分析已解析的各類(lèi)光合細(xì)菌反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu)信息，并結(jié)合分子進(jìn)化學(xué)研究推測(cè)各類(lèi)光合細(xì)菌反應(yīng)中心的進(jìn)化關(guān)系如圖1所示。

圖1 光合細(xì)菌反應(yīng)中心進(jìn)化關(guān)系圖[2]

已有研究廣泛認(rèn)為，type-I和type-II型反應(yīng)中心起源于原始同質(zhì)二聚體反應(yīng)中心，之后逐漸進(jìn)化為不同類(lèi)型的反應(yīng)中心[14-16]。生化結(jié)果表明，綠菌門(mén)和酸桿菌門(mén)光合細(xì)菌的反應(yīng)中心在多肽序列和色素組成上接近，二者反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu)同源性較高[17]。因此，對(duì)于這兩類(lèi)光合細(xì)菌反應(yīng)中心結(jié)構(gòu)的解析成為光合細(xì)菌反應(yīng)中心結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的“最后一座堡壘”。

2 綠硫細(xì)菌光反應(yīng)系統(tǒng)

綠硫細(xì)菌屬于綠菌門(mén)，是一類(lèi)嚴(yán)格厭氧的光合自養(yǎng)型細(xì)菌，能夠在極弱的光照環(huán)境下進(jìn)行光合作用，因而被稱(chēng)為“黑暗中的捕光者”[18-20]。嗜熱型綠硫細(xì)菌Chlorobaculum tepidum (早期稱(chēng)Chlorobium tepidum, C. tepidum)是綠硫細(xì)菌的代表性菌種，最早由Wahlund等[21]分離自新西蘭的火山溫泉，為革蘭氏陰性菌。C. tepidum的培養(yǎng)需嚴(yán)格厭氧，最適生長(zhǎng)溫度為47 ℃，一般細(xì)胞大小(0.6～0.8) μm×(1.3～2.6) μm。綠硫細(xì)菌光反應(yīng)系統(tǒng)由三部分構(gòu)成：外周捕光天線(綠小體)、中間能量傳遞系統(tǒng)(FMO蛋白)和反應(yīng)中心復(fù)合體(圖2)[22]。

圖2 綠硫細(xì)菌光反應(yīng)系統(tǒng)示意圖[22]

綠小體是由單層生物膜包裹數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)菌葉綠素分子而形成的長(zhǎng)120～200 nm、寬40～80 nm的橢球形結(jié)構(gòu)，是自然界已知生物體內(nèi)最大的捕光天線。綠小體內(nèi)部不存在蛋白結(jié)構(gòu)，葉綠素分子完全通過(guò)化學(xué)自組裝的方式形成有序的片層結(jié)構(gòu)，再由片層結(jié)構(gòu)進(jìn)一步彎曲重疊形成套筒狀的橢球結(jié)構(gòu)[23-26]。綠小體靠近細(xì)胞膜的一側(cè)形成由細(xì)菌葉綠素a(BChl a)和CsmA蛋白構(gòu)成的能量受體“基板”，通過(guò)該結(jié)構(gòu)綠小體捕獲的光能被傳遞至內(nèi)側(cè)FMO蛋白[22,27]。

FMO連接綠小體能量基板和反應(yīng)中心，每個(gè)FMO包含3個(gè)呈C3軸對(duì)稱(chēng)排列的同質(zhì)單體(圖3)。每個(gè)FMO單體分子量約42 kDa，形狀類(lèi)似雪茄，結(jié)合8個(gè)細(xì)菌葉綠素(編號(hào)1至8號(hào))。色素分子主要被包裹在β折疊片富集的蛋白外殼內(nèi)部，其中，第1～7號(hào)細(xì)菌葉綠素分子排列較為緊湊，而第8號(hào)細(xì)菌葉綠素靠近相鄰FMO單體中的1號(hào)細(xì)菌葉綠素[28-30]。每個(gè)FMO單體中的第3號(hào)細(xì)菌葉綠素的能態(tài)最低，因而被認(rèn)為是FMO內(nèi)部能量傳遞的終點(diǎn)[31-33]。FMO不僅作為能量傳遞體將激發(fā)能傳遞至反應(yīng)中心，而且在強(qiáng)光照的環(huán)境下具有光保護(hù)功能[29]。

圖3 FMO晶體結(jié)構(gòu)及內(nèi)部色素排列[31]：(a) FMO三聚體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(平行C3軸視角)；(b) FMO三聚體內(nèi)部細(xì)菌葉綠素排布；(c) FMO單體內(nèi)部細(xì)菌葉綠素排布(垂直C3軸視角)

綠硫細(xì)菌反應(yīng)中心(GsbRC)由4個(gè)蛋白亞基(PscA/PscB/PscC/PscD)構(gòu)成[34]。綠硫細(xì)菌C.tepidum基因組測(cè)序結(jié)果顯示，該細(xì)菌基因組內(nèi)僅存在核心亞基PscA的編碼基因，而沒(méi)有與PscA相似的第二個(gè)亞基存在，由此推測(cè)GsbRC核心為同質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)[35-36]。氨基酸序列比對(duì)分析表明，盡管PscA與PSI的核心亞基PsaA/B一致性(identity)較低，但其三維結(jié)構(gòu)可能較為保守[37]。外周亞基PscB分子量約為23 kDa，包含231個(gè)氨基酸殘基，其中，N末端存在多個(gè)富含脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)和賴(lài)氨酸(Lys)殘基的重復(fù)片段。PscB具有兩個(gè)鐵硫簇結(jié)合位點(diǎn)并與PsaC的鐵硫簇結(jié)合位點(diǎn)氨基酸序列高度保守[34]。PscD分子量約為15 kDa，生理功能尚不確定，推測(cè)其參與電子由反應(yīng)中心向鐵氧還蛋白(Fd)的傳遞[38]。遺傳突變研究發(fā)現(xiàn)，PscB與PscD對(duì)于穩(wěn)定FMO與反應(yīng)中心所形成的復(fù)合物具有重要作用[34]。PscC是一個(gè)細(xì)胞色素蛋白(Cyt c551)，分子量約為17 kDa，由C末端血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)已被解析)和N末端跨膜結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)尚未見(jiàn)報(bào)道)構(gòu)成[39]。

Permentier等[40]早期對(duì)GsbRC進(jìn)行的色素定量分析表明，GsbRC內(nèi)部結(jié)合大約20個(gè)葉綠素分子，包括16個(gè)細(xì)菌葉綠素(BChl a)、2個(gè)酯化葉綠素(Chl a670)和1對(duì)特殊細(xì)菌葉綠素(稱(chēng)為P840)[40-42]。

GsbRC為type-I型。與其他type-I型反應(yīng)中心相比，GsbRC在蛋白亞基和色素組成上均存在較大差異，尤其色素?cái)?shù)量明顯減少。這些特征暗示GsbRC具有特殊的光合作用機(jī)制[7,10,34]。

盡管早期對(duì)于GsbRC的生化研究較多，但其原子結(jié)構(gòu)的解析一直沒(méi)有突破。Tsiotis等[43]最早利用掃描透射電子顯微鏡技術(shù)(STEM，100 kV)對(duì)C.tepidum反應(yīng)中心進(jìn)行成像分析，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合體與藍(lán)細(xì)菌光系統(tǒng)I單體顆粒的大小接近，呈14 nm長(zhǎng)、8 nm寬且具有假二重對(duì)稱(chēng)的單體構(gòu)造。Remigy等[44]通過(guò)改進(jìn)樣品制備方法獲得更加完整的反應(yīng)中心復(fù)合體樣品，并通過(guò)STEM成像后得到反應(yīng)中心結(jié)合一個(gè)FMO復(fù)合體(FMO-GsbRC)的低分辨率(17 ?)模型。Bína等[45]利用透射電鏡技術(shù)直接對(duì)綠硫細(xì)菌細(xì)胞膜樣品進(jìn)行成像分析，推測(cè)在生理狀態(tài)下存在由2個(gè)反應(yīng)中心和4個(gè)FMO復(fù)合體構(gòu)成的超級(jí)復(fù)合體(4FMO-2GsbRC)，且每個(gè)綠小體平均結(jié)合30個(gè)反應(yīng)中心和60個(gè)FMO復(fù)合體。

近期，我們利用單顆粒冷凍電子顯微鏡技術(shù)解析了綠硫細(xì)菌FMO-反應(yīng)中心復(fù)合體(FMOGsbRC)2.7 ?分辨率的原子結(jié)構(gòu)，為闡明復(fù)合體內(nèi)部能量傳遞機(jī)制提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[46]。

3 綠硫細(xì)菌FMO-反應(yīng)中心復(fù)合體原子結(jié)構(gòu)

3.1 整體結(jié)構(gòu)模型

如圖4所示，F(xiàn)MO-GsbRC復(fù)合體整體包括胞質(zhì)側(cè)的FMO和鑲嵌在膜上的GsbRC兩部分。整個(gè)復(fù)合體長(zhǎng)度約16 nm，寬度約10 nm，高度約12 nm。GsbRC核心部分是兩個(gè)呈C2對(duì)稱(chēng)的PscA亞基構(gòu)成的跨膜同質(zhì)二聚體，分別標(biāo)記為PscA1和PscA2。三個(gè)FMO單體(分別標(biāo)記為FMO-1、FMO-2、FMO-3)結(jié)合于GsbRC胞質(zhì)側(cè)且靠近核心亞基PscA1一端，而PscA2側(cè)沒(méi)有結(jié)合FMO。外周亞基PscB和PscD位于PscA二聚體核心上方，且均靠近FMO與PscA1的界面。該模型中缺少PscC亞基，推測(cè)其可能在樣品制備中丟失[34,47]。

圖4 綠硫細(xì)菌FMO-GsbRC復(fù)合體結(jié)構(gòu)模型(PDB ID: 6M32)：(a) 復(fù)合體蛋白結(jié)構(gòu)；(b) 復(fù)合體內(nèi)部輔因子空間排列

整個(gè)復(fù)合體共結(jié)合67個(gè)輔因子，包括FMO內(nèi)結(jié)合的24個(gè)細(xì)菌葉綠素a(每個(gè)FMO單體結(jié)合8個(gè)細(xì)菌葉綠素a)、GsbRC結(jié)合的30個(gè)葉綠素(包括26個(gè)細(xì)菌葉綠素a和4個(gè)葉綠素a異構(gòu)體)、4個(gè)類(lèi)胡蘿卜素(2個(gè)綠菌烯和2個(gè)綠菌烯酯)、4個(gè)脂分子(2個(gè)PG和2個(gè)MGDG)、2個(gè)鈣離子，以及3個(gè)鐵硫簇(Fe4S4)。

與日光桿菌反應(yīng)中心(HbRC)和光系統(tǒng)I(PSI)的結(jié)構(gòu)類(lèi)似，GsbRC每個(gè)PscA亞基包含11次跨膜螺旋，分為天線結(jié)構(gòu)域和電子傳遞結(jié)構(gòu)域，鐵硫簇FX位于兩個(gè)PscA亞基對(duì)稱(chēng)軸且被兩對(duì)半胱氨酸殘基固定。GsbRC的跨膜區(qū)與紫細(xì)菌反應(yīng)中心(PbRC)、HbRC、PSI和光系統(tǒng)II(PSII)的跨膜區(qū)存在很高的保守性，而非跨膜區(qū)(特別是周質(zhì)側(cè))的結(jié)構(gòu)差異明顯，暗示其與各自不同的電子供體存在特異的相互作用。

3.2 反應(yīng)中心輔因子排列

GsbRC結(jié)合的葉綠素分子數(shù)量(包括26個(gè)細(xì)菌葉綠素a和4個(gè)酯化葉綠素a)明顯少于已報(bào)道的其他type-I型反應(yīng)中心(HbRC結(jié)合60個(gè)葉綠素，PSI核心結(jié)合87個(gè)葉綠素)，而與PSII核心結(jié)合的葉綠素?cái)?shù)量(35個(gè)葉綠素和2個(gè)脫鎂葉綠素)接近。不過(guò)，GsbRC與HbRC及PSI核心中葉綠素分子的排布具有很高的保守性(圖5)。GsbRC的葉綠素排布為三個(gè)明顯的葉綠素分子簇，即位于中心電子傳遞結(jié)構(gòu)域的葉綠素分子簇，以及聚集于兩側(cè)天線結(jié)構(gòu)域的葉綠素分子簇，且這些色素的空間位置和取向與PSII核心中相關(guān)葉綠素分子十分接近(圖5)。因此，GsbRC的葉綠素空間排布具有type-I和type-II兩種光合反應(yīng)中心葉綠素分子的空間排布特點(diǎn)，暗示其可能作為光系統(tǒng)進(jìn)化的祖先，通過(guò)后期進(jìn)化而分裂成兩種反應(yīng)中心。

圖5 GsbRC與三種反應(yīng)中心(PSII-RC、HbRC、PSI-RC)核心葉綠素排列比較[46]

GsbRC的天線葉綠素分子在細(xì)胞膜平面呈雙層排布，分別位于膜的胞質(zhì)側(cè)和基質(zhì)側(cè)，但兩層葉綠素分子之間缺失在PSII、HbRC以及PSI核心的天線葉綠素分子層之間均存在的中間葉綠素分子(本文稱(chēng)為linker葉綠素)，而是通過(guò)兩個(gè)類(lèi)胡蘿卜素衍生物hydroxychlorobactene glucoside laurate (在PDB中標(biāo)記為F39)連接，該分子的具體生物學(xué)功能尚不確定(圖6)。

圖6 GsbRC與三種反應(yīng)中心(PSII-RC、HbRC、PSI-RC)葉綠素分子層排列比較[46]

3.3 電子傳遞鏈

GsbRC內(nèi)兩條電子傳遞鏈的輔因子排列如圖7所示。三對(duì)葉綠素分子呈對(duì)稱(chēng)排列，相鄰色素(P840-ACC、ACC-A0)中心鎂原子距離分別為12.7 ?和10.0 ?。次級(jí)電子受體(A0)與第一個(gè)鐵硫簇(FX)間中心原子的距離為18.1 ?，三個(gè)鐵硫簇之間中心原子的相鄰距離分別為15.2 ?和12.7 ?。構(gòu)成反應(yīng)中心特殊葉綠素對(duì)的兩個(gè)細(xì)菌葉綠素分子中心鎂原子間的距離為6.5 ?，卟啉環(huán)平面的垂直距離為3.3 ?。

對(duì)結(jié)構(gòu)已解析的type-I型反應(yīng)中心電子傳遞鏈進(jìn)行比較可知：GsbRC與HbRC電子傳遞鏈中輔因子的排布相似，二者的兩條電子傳遞鏈排列是對(duì)稱(chēng)的，且相鄰輔因子間的距離接近；而在PSI核心中，兩條電子傳遞鏈的排列是不對(duì)稱(chēng)的，且第三對(duì)葉綠素分子與第一個(gè)鐵硫簇(FX)之間的距離明顯大于HbRC和GsbRC電子傳遞鏈中對(duì)應(yīng)的A0-FX間的距離，它們之間的電子傳遞是由一個(gè)醌分子介導(dǎo)的(圖7)。然而在HbRC和GsbRC的電子傳遞鏈中，第三對(duì)葉綠素與鐵硫簇之間均沒(méi)有觀察到醌分子，考慮到二者間的距離較近，醌分子可能并不是其間電子傳遞所必需的[10]。

圖7 三種type-I型反應(yīng)中心電子傳遞鏈進(jìn)行比較[46]：(a) HbRC；(b)GsbRC；(c)PSI-RC

3.4 FMO-反應(yīng)中心復(fù)合體內(nèi)部能量傳遞機(jī)制

在綠硫細(xì)菌的光反應(yīng)階段，光能被綠小體捕獲后經(jīng)FMO傳遞至反應(yīng)中心。早期研究表明，能量在綠小體內(nèi)部、綠小體與FMO間、FMO內(nèi)部的傳遞效率接近100%，類(lèi)似于高等植物捕光天線LHCI內(nèi)以及由LHCI向PSI核心的能量傳遞效率。不過(guò)，在活體細(xì)胞中能量由FMO向反應(yīng)中心的傳遞效率低于75%，在分離純化的FMOGsbRC系統(tǒng)中能量傳遞效率更低(＜50%)[48-53]。

由FMO-GsbRC冷凍電鏡結(jié)構(gòu)可知，F(xiàn)MO與GsbRC的膜平面呈傾斜排布，結(jié)合于FMO-2和FMO-3的細(xì)菌葉綠素分子(BChl-8)處于整個(gè)分子表面的最外側(cè)，因而更容易從綠小體獲得能量(圖8)。

圖8 FMO-GsbRC復(fù)合體內(nèi)部可能的能量傳遞途徑[46]。(a) 綠硫細(xì)菌“綠小體FMO-GsbRC”系統(tǒng)內(nèi)部能量傳遞示意圖；(b) FMO與GsbRC界面細(xì)菌葉綠素分子排列；(c) FMO與GsbRC界面一段富含芳香族氨基酸的螺旋結(jié)構(gòu)

激發(fā)能經(jīng)過(guò)FMO內(nèi)部色素分子網(wǎng)絡(luò)傳遞至反應(yīng)中心，見(jiàn)圖8(a)。在FMO與GsbRC之間的葉綠素分子相隔距離較遠(yuǎn)，其中，BChl-3 (FMO-1)和BChl-3 (FMO-2)與反應(yīng)中心上層細(xì)菌葉綠素BChl-808和BChl-810的距離分別為22 ?和23 ?，而B(niǎo)Chl-3 (FMO-3)與反應(yīng)中心上層細(xì)菌葉綠素的最近距離超過(guò)33 ?(圖8(b))。因此，能量由FMO向反應(yīng)中心傳遞主要通過(guò)BChl-3 (FMO-1)和BChl-3 (FMO-2)。

在高等植物PSI-LHCI能量傳遞系統(tǒng)中，天線LHCI與PSI核心之間存在較多的gap chlorophylls，相鄰葉綠素分子間的距離為8～13 ?，因而能量能夠在色素分子間進(jìn)行高效傳遞[54-55]。然而，在FMO-GsbRC系統(tǒng)中，F(xiàn)MO與GsbRC結(jié)合的色素分子之間存在較大的間隔，這可能是造成能量在FMO與GsbRC之間傳遞效率低的主要原因。

早期對(duì)FMO內(nèi)部能量傳遞機(jī)制的研究表明，位于BChl-3和BChl-4附近的兩個(gè)短α螺旋對(duì)于能量在色素分子間的分布存在明顯的影響[56]。由FMOGsbRC結(jié)構(gòu)模型可知，在FMO-2的兩個(gè)細(xì)菌葉綠素分子(BChl-3和BChl-4)與PscA1結(jié)合的兩個(gè)葉綠素分子(A805和A810)之間存在一段包含多個(gè)芳香族氨基酸的α螺旋(圖8(c))，該結(jié)構(gòu)可能對(duì)于能量從FMO向GsbRC的傳遞具有促進(jìn)作用。

4 總結(jié)與展望

綠硫細(xì)菌反應(yīng)中心是一種重要的光合細(xì)菌反應(yīng)中心，代表了type-I光系統(tǒng)的起源。綠硫細(xì)菌反應(yīng)中心原子結(jié)構(gòu)的解析對(duì)于探究地球早期光合生物的光合作用機(jī)制、揭示兩個(gè)光系統(tǒng)從早期光合反應(yīng)中心的進(jìn)化具有重要意義。綠硫細(xì)菌的光反應(yīng)系統(tǒng)包括綠小體、FMO和反應(yīng)中心三部分，但目前我們僅僅解析了其中一部分的空間構(gòu)造，而完整光反應(yīng)系統(tǒng)構(gòu)造的解析對(duì)于闡明綠硫細(xì)菌的光合作用機(jī)制十分必要。