中草藥乙醇提取物對(duì)5種常見(jiàn)霉菌抑制效果的研究

方改霞，耿璐璐，黃金絨，侯凱玉，洪 軍，李冰冰

(1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036;2.河南省健康食品工程技術(shù)研究中心，河南 平頂山 467036)

霉菌在食品、農(nóng)產(chǎn)品及食用菌栽培基質(zhì)等方面均有較大危害。常見(jiàn)的主要有黑曲霉(Aspergillusnige)、黑根霉(Rhizopusnigricans)、綠色木霉(Trichodermaviride)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)以及黃曲霉(Aspergillusflavus)等。目前針對(duì)霉菌的防治多采用化學(xué)消毒劑，但往往會(huì)污染環(huán)境及影響人體健康，這一問(wèn)題已引起了全球性關(guān)注。為避免化學(xué)物質(zhì)的影響，一些植物的天然產(chǎn)物已被證明是好的真菌抑制物[1-2]。丁香、花椒、黃芩等中藥材提取物對(duì)多種真菌具有明顯抑制作用[3-6]；土荊皮含有多種抗真菌的有效成分，并且可以與中藥和西藥聯(lián)合制成復(fù)方制劑，增強(qiáng)其抑菌作用[7]。Muswar Ali Gadhi等[8]發(fā)現(xiàn)植物(芝麻、椰子、指甲花、薄荷、黑籽等)精油也能有效抑制由鏈格孢菌引起的鷹嘴豆出現(xiàn)的葉枯病，并可用于生物防治。豆康寧等[9]把甘草粉及其甘草黃酮成分作用于面包，起到了防腐效果等。而若對(duì)單味中藥進(jìn)行合理的配伍組合成復(fù)方藥，利用復(fù)配中多味理化性質(zhì)不同的中藥成分之間的相互作用，從而改變復(fù)方藥物的整體活性或毒性[10]，通常能提高藥效，降低藥物毒性[11-15]。因此以單味中草藥進(jìn)行配伍來(lái)尋找新的抗霉菌藥物是一個(gè)可行的途徑。

本研究以5株霉菌為指示菌，測(cè)定丁香、土荊皮、花椒、黃連、甘草等21種單味中草藥醇提物的抗霉菌效果，并研究了不同中草藥配伍后對(duì)霉菌協(xié)同抑制效果，以期為開(kāi)發(fā)天然綠色的新型抗霉菌藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：綠色木霉CICC13015、黑根霉(M.racemosus，3.413)、黑曲霉BNCC340101、桔青霉ATCC1109以及黃曲霉AS3.39505均由河南省健康食品工程技術(shù)研究中心提供。

中草藥：丁香、花椒、黃柏、金銀花、黃連、大青葉、野菊花、連翹、蒲公英、甘草、大黃、高良姜、桔皮、石榴皮、土荊皮、蛇床子、千里光、川楝子、合歡皮、檸檬皮等均購(gòu)自河南省平頂山市張仲景大藥房；桉葉購(gòu)自淘寶網(wǎng)店方士居。

1.2 主要試劑

PD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、0.5%多菌靈、生理鹽水以及無(wú)水乙醇等，均由平頂山市偉業(yè)物資經(jīng)營(yíng)公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與菌懸液制備

將二代斜面霉菌菌種接種至PD液體培養(yǎng)基，150 r/min，于25 ℃培養(yǎng)2～3 d后取菌懸液畫(huà)線(xiàn)于PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d后用無(wú)菌生理鹽水沖洗，并用8層紗布過(guò)濾除去菌絲體，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)霉菌孢子懸液計(jì)數(shù)后，將濃度調(diào)整為105cfu/mL，用于抑菌實(shí)驗(yàn)[16]。

1.3.2 中草藥有效成分的提取

采用索氏醇提法提取中草藥[17]。稱(chēng)取50 g粉碎后過(guò)40目篩網(wǎng)的中草藥粉末裝入濾紙桶中，將濾紙桶放入索氏提取器萃取室內(nèi)，當(dāng)萃取室內(nèi)藥液顏色變淺或無(wú)色時(shí)，即萃取完成。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液濃縮至50 mL，制得原液，其生藥濃度為1 g/mL。文中濃度均為生藥濃度。

1.3.3 中草藥提取液抑菌圈測(cè)定

采用牛津杯法[18]測(cè)定抑菌圈直徑，接藥量為100 μL/杯。實(shí)驗(yàn)平板培養(yǎng)72 h。

抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)[19]：抑菌圈直徑>15 mm表明，該微生物對(duì)抑菌劑高度敏感；11～15 mm為中度敏感，6～10 mm為低度敏感，而6 mm為不敏感。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及SPSS 21分析

數(shù)據(jù)均為3組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；用SPSS 21軟件對(duì)抑菌效果較好的單劑及復(fù)合劑進(jìn)行單因素方差分析，若P>0.05，無(wú)顯著性差異；P<0.05，有顯著性差異；若P<0.01，呈極顯著差異。

1.3.5 共毒系數(shù)法

共毒系數(shù)CTC=(混劑實(shí)測(cè)毒性指數(shù)ATI/混劑理論毒性指數(shù)TTI)×100%

其中：混劑實(shí)測(cè)毒性指數(shù)ATI∝混劑抑菌圈直徑；混劑理論毒性指數(shù)TTI∝A藥劑抑菌圈直徑×混劑中A藥劑百分含量+B藥劑抑菌圈直徑×混劑中B藥劑百分含量；共毒系數(shù)CTC>1.2為協(xié)同作用，CTC<0.8為拮抗作用，0.8

2 結(jié)果與分析

2.1 單劑中草藥的篩選結(jié)果及分析

將21種中草藥提取物分別與黑曲霉、黑根霉、綠色木霉、黃曲霉和桔青霉作用72 h(作用時(shí)間，下同),發(fā)現(xiàn)丁香、黃連、土荊皮、花椒、甘草等對(duì)一定的霉菌抑菌效果較好，詳見(jiàn)表1和表2。效果較差的未一一列出。

表1 單劑提取液對(duì)霉菌的抑菌圈測(cè)定 (抑菌圈直徑/mm)

續(xù)表1

丁香對(duì)5種霉菌均有明顯的抑菌效果，在0.2～1.0 g/mL范圍內(nèi)僅對(duì)綠色木霉的作用有顯著性差異，其最佳抑菌濃度為0.4 g/mL。結(jié)合其差異性分析及對(duì)霉菌的抑制效果選出5個(gè)濃度：0.4 g/mL、0.5 g/mL、0.6 g/mL、0.7 g/mL、0.9 g/mL；土荊皮對(duì)黑曲霉、黑根霉、黃曲霉和桔青霉均有明顯的抑菌效果，但不同濃度之間均無(wú)顯著性差異，同理選出5個(gè)濃度：0.3 g/mL、0.4 g/mL、0.7 g/mL、0.9 g/mL、1.0 g/mL；花椒對(duì)黑根霉有明顯的抑菌效果，但各濃度間無(wú)顯著性差異，故選出3個(gè)濃度：0.3 g/mL、0.7 g/mL、1.0 g/mL；甘草對(duì)黑根霉和綠色木霉均有明顯的抑菌效果，且對(duì)綠色木霉有顯著性差異，其最佳抑菌濃度為0.8 g/mL和1.0 g/mL，再結(jié)合經(jīng)濟(jì)性原則選出3個(gè)濃度：0.4 g/mL、0.8 g/mL、1.0 g/mL；黃連對(duì)綠色木霉有明顯的抑菌效果且具有顯著性差異，其最佳抑菌濃度為0.7 g/mL和0.9 g/mL，同理選出了3個(gè)最佳濃度：0.5 g/mL、0.7 g/mL以及0.9 g/mL。

據(jù)上，最終確定以丁香、黃連、土荊皮、花椒及甘草5種中草藥及相應(yīng)濃度進(jìn)行后續(xù)組合配伍實(shí)驗(yàn)。

2.2 二種中草藥配伍復(fù)合劑的篩選結(jié)果及分析

對(duì)所挑選的單劑中草藥進(jìn)行二種組合，共得142種組合；分別對(duì)5種霉菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，從中挑選出抑菌效果較好的20種組合，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 二種中草藥提取液配伍復(fù)合劑對(duì)霉菌的抑菌結(jié)果

續(xù)表2

丁香/土荊皮組合、丁香/黃連組合、丁香/花椒組合、土荊皮/黃連組合、土荊皮/甘草組合和土荊皮/花椒組合在相應(yīng)濃度下對(duì)5種實(shí)驗(yàn)霉菌均有明顯的抑菌效果，且對(duì)各菌株具顯著性差異(P<0.05)；丁香/甘草組合則對(duì)實(shí)驗(yàn)霉菌有明顯的抑菌效果，但對(duì)各菌株不具有顯著性差異(P>0.05)；甘草/黃連組合、甘草/花椒組合、花椒/黃連組合對(duì)黑曲霉、黃曲霉、桔青霉的抑菌效果較弱，不再作為進(jìn)一步篩選對(duì)象。

2.3 三種中草藥配伍復(fù)合劑的篩選結(jié)果及分析

為避免藥與藥之間的配伍拮抗作用，對(duì)所得三種中草藥的36種配伍組合再進(jìn)行抑菌效果實(shí)驗(yàn)，得到11種抑菌效果較好的三種中草藥配伍復(fù)合劑，結(jié)果見(jiàn)表3。表3中丁香/土荊皮/花椒、丁香/土荊皮/黃連在對(duì)應(yīng)濃度下對(duì)5種霉菌的抑菌效果具有顯著性差異，其他組合則無(wú)。土荊皮/黃連/花椒組合、土荊皮/花椒/甘草組合、土荊皮/黃連/甘草組合對(duì)4種實(shí)驗(yàn)霉菌的殺菌效果不及某些兩種中草藥配伍組合，故篩除。

表3 三種中草藥提取液配伍復(fù)合劑對(duì)霉菌的抑菌結(jié)果

2.4 四種中草藥配伍復(fù)合劑的篩選結(jié)果及分析

同上節(jié)所述，選擇性配伍四種中草藥復(fù)合并進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，共9種組合，其結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：中草藥組合各組間標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。圖1 四種中草藥提取液配伍復(fù)合劑對(duì)霉菌的抑菌結(jié)果

表4中丁香/土荊皮/花椒/黃連組合、丁香/土荊皮/花椒/甘草組合在對(duì)應(yīng)濃度下對(duì)5種霉菌均具有顯著性差異(P<0.05)，其中⑤和⑥這兩種組合抑菌效果極顯著(P<0.01)。同時(shí)對(duì)四種中草藥配伍復(fù)合劑進(jìn)行共毒系數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)這9種由四種中草藥的組合劑均呈現(xiàn)出協(xié)同(CTC>1.2)或累加作用(0.81.2)。綜上分析，⑤和⑥這兩種組合劑不但抑菌效果較好，而且各藥成分間呈協(xié)同作用。

表4 四種中草藥提取液配伍復(fù)合劑對(duì)霉菌的共毒系數(shù)

2.5 五種中草藥配伍復(fù)合劑的抑菌及篩選結(jié)果

對(duì)表4選出的四種中草藥配伍復(fù)合劑進(jìn)行選擇性配伍，得到6種五種中草藥配伍組合。與圖1相比，圖2顯示五種中草藥配伍復(fù)合劑抑菌效果遠(yuǎn)不如其他組合復(fù)合劑，且該復(fù)合劑所涉及中草藥較多，經(jīng)濟(jì)效益不明顯，故該組合不作為最終復(fù)合劑的篩選對(duì)象。

2.6 最終目標(biāo)制劑的選定

分別對(duì)表5中抑菌效果較佳的二種、三種和四種中草藥配伍復(fù)合劑進(jìn)行抑菌效果顯著性分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)合劑5和復(fù)合劑6對(duì)5種霉菌的抑菌效果突出，進(jìn)一步做SPSS單因素方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 中草藥復(fù)合劑5和復(fù)合劑6單因素方差分析

據(jù)表6可知，該組合對(duì)各污染霉菌的抑制效果不具有顯著性。因此中草藥復(fù)合劑5和6屬于廣譜殺菌劑，故最終確定C丁香C土荊皮C花椒C黃連=0.9 g/mL0.4 g/mL0.7 g/mL0.5 g/mL和C丁香C土荊皮C花椒C甘草=0.4 g/mL0.9 g/mL0.3 g/mL0.4 g/mL作為目標(biāo)中草藥復(fù)方劑。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

綜合中草藥乙醇提取物的單劑和復(fù)合劑的抑菌效果及經(jīng)濟(jì)成本，最終配伍篩選出了含有丁香、土荊皮、花椒以及黃連或甘草等乙醇提取物組成的2種抑制霉菌效果較佳的中草藥復(fù)方劑。

3.2 討論

本試驗(yàn)首先利用21種中草藥乙醇提取物分別作用于黑曲霉、黑根霉、綠色木霉、黃曲霉和桔青霉，發(fā)現(xiàn)土荊皮抑菌效果明顯，這與付雯[20]等選用12種中草藥作用于桔青霉時(shí)所得結(jié)果一致，同時(shí)發(fā)現(xiàn)土荊皮浸提物在抑菌過(guò)程中，若噴灑頻率合適，其效果可能會(huì)高于化學(xué)殺菌劑，故本試驗(yàn)后期可進(jìn)一步探究對(duì)中草藥的作用時(shí)間；同時(shí)本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，丁香、花椒、甘草及黃連等中草藥醇提物也有較好地抑菌效果。

目前臨床上常采用聯(lián)合用藥治療真菌耐藥問(wèn)題，其理論基礎(chǔ)是不同藥物抑制微生物代謝的不同階段或不同靶位而產(chǎn)生協(xié)同作用；經(jīng)共毒系數(shù)法復(fù)證，在所選20種二種配伍、11種三種配伍中，其抑菌效果與同濃度單劑相比，大多表現(xiàn)為協(xié)同或累加，少數(shù)為拮抗，且拮抗是與個(gè)別霉菌作用時(shí)的效果，而所選的9種四種配伍與同濃度單劑相比均表現(xiàn)為協(xié)同或累加，其中配伍復(fù)合劑5、6的藥效均為較強(qiáng)協(xié)同作用，但由于篩選配伍時(shí)首先關(guān)注的是抑菌效果，其次才關(guān)注藥物間的相互作用，故效果最佳的配伍復(fù)合劑可能未被選出。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)二種配伍土荊皮與花椒聯(lián)合作用于綠色木霉時(shí)有明顯抑菌作用，而單劑土荊皮、花椒則對(duì)綠色木霉無(wú)明顯抑菌效果，該原因值得進(jìn)一步探究。王柱華[21]發(fā)現(xiàn)黃連乙醇提取物對(duì)白色念珠菌具有顯著地抑菌效果，在一定濃度范圍內(nèi),黃連提取物的抗真菌作用隨藥液濃度的增大而增強(qiáng),呈劑量依賴(lài)性，并且黃連和黃芩這兩種藥物對(duì)白色念珠菌的抑制作用效果最好。周學(xué)東等[22]發(fā)現(xiàn)丁香提取液對(duì)黑曲霉、擴(kuò)展青霉也有很好地抑制作用，這提示該試驗(yàn)研制的配方可能對(duì)白色念珠菌和擴(kuò)展青霉也有一定的抑制效果，這有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

中草藥成分復(fù)雜，粗提物中抗菌有效成分不太明確，含量也相對(duì)較少，所以應(yīng)進(jìn)一步深入探究這兩種中草藥制劑中的抗真菌作用的單體活性成分，以及提取方法等條件的優(yōu)化，力求發(fā)掘新的抗霉菌藥物。