超聲波-微波提取香蕉皮中抑菌物質(zhì)的工藝優(yōu)化

劉俊紅，梅淑敏，郝朝陽，樊媛芳，洪 軍

(河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036)

2010年中國香蕉總產(chǎn)量為948.8萬 t，居世界第3位[1]。但香蕉屬于呼吸躍變型水果，容易發(fā)生變質(zhì)，且貯運(yùn)和保鮮難，對香蕉進(jìn)行深加工制成系列產(chǎn)品是提高其附加值的有效途徑之一。但是對香蕉進(jìn)行深加工的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的香蕉皮(占果實(shí)總重量的25%～35%)。

研究結(jié)果表明香蕉皮中含有大量的果膠、膳食纖維、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和脂肪，Zn、Fe、K、Ca、Mg的含量也相當(dāng)豐富，極具開發(fā)價(jià)值[2]。因此，對香蕉皮進(jìn)行綜合開發(fā)利用，不僅可以保護(hù)環(huán)境而且還能創(chuàng)造更多的經(jīng)濟(jì)效益。目前已有相關(guān)文獻(xiàn)研究利用香蕉皮提取膳食纖維、果膠及多糖等其他營養(yǎng)物質(zhì)[3-5]，但是對于香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取和檢測的研究報(bào)道較少。

超聲波輔助提取是通過超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機(jī)械作用，破碎原料的細(xì)胞壁，促進(jìn)提取劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與目標(biāo)提取成分充分混合，加快細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)溶出、釋放以及擴(kuò)散，從而提高提取效率[6]。

朱超峰等通過超聲波輔助化學(xué)法提取香蕉皮中的多酚物質(zhì)，多酚提取量為 25.29 mg/g。香蕉皮多酚物質(zhì)的抗氧化活性隨濃度增加而增強(qiáng)[7]。

研究顯示，植物中的多酚和有機(jī)酸等有效成分不僅有抗氧化、預(yù)防心血管疾病發(fā)生、抗癌、抑菌消炎、抗病毒等作用，而且還可以作為食品添加劑以及酒類和飲料澄清劑[8-9]。從節(jié)約資源保護(hù)環(huán)境的角度考慮，對香蕉皮進(jìn)行研究，可以提高香蕉皮的綜合利用，變廢為寶。

本文研究了從香蕉皮中提取抑菌物質(zhì)的優(yōu)化工藝條件，旨在制備一種經(jīng)濟(jì)有效、安全穩(wěn)定的天然食品防腐劑，為進(jìn)一步開發(fā)利用廢棄香蕉果皮資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

稱取一定量香蕉皮浸泡于濃度5%的檸檬酸溶液中5 min，之后用打漿機(jī)粉碎，用研缽研磨。

1.1.2 主要試劑

NaOH(分析純)：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；乙醇(分析純)：洛陽市化學(xué)試劑廠；檸檬酸(分析純)：天津博迪化工股份有限公司；瓊脂(分析純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯化鈉(分析純)：洛陽市化學(xué)試劑廠；酵母提取物(分析純)：北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨(分析純)：北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

L530低速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MM721NH1-PW微波爐：廣東美的廚房電器制造有限公司；九陽JYL-C012料理機(jī)：九陽股份有限公司；BCD-160TMPQ冰箱：青島海爾股份有限公司；KQ5200DB型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高壓滅菌鍋：上海富士工器有限公司；SHA-B/C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以香蕉皮為實(shí)驗(yàn)原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)研究影響香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取效果的各個(gè)因素(乙醇濃度、液固比、超聲波功率、超聲波時(shí)間、超聲波溫度等)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。每個(gè)因素做五個(gè)梯度，三個(gè)平行。

(1)乙醇濃度對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的實(shí)驗(yàn)。

乙醇濃度：40%、50%、60%、70%、80% ，液固比101，超聲波功率120 W、超聲波時(shí)間40 min、超聲波溫度50 ℃，反應(yīng)后放在微波中350 W處理60 s，之后離心(3 000 r/min，5 min)取上清液待測。

大腸桿菌(ATCC25922)的培養(yǎng)：將滅菌的液體培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，每個(gè)試管用移液槍加4 mL，選擇菌種與液體培養(yǎng)基1100的比例，在試管中接種保存的大腸桿菌菌種，37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈時(shí)將培養(yǎng)好的大腸桿菌使用無菌生理鹽水配制成濃度為104～105CFU/mL(每毫升樣品中含有的細(xì)菌群落總數(shù))孢子或菌體懸浮液[10]。

抑菌圈直徑大小的測定：采用濾紙片法，將直徑為6 mm的濾紙片滅菌備用。將制備好的104～105CFU/mL菌懸液0.1 mL滴入到已加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，使用滅菌玻璃棒均勻涂布，用無菌鑷子將濾紙片均勻分散放入含菌平皿中，每皿中放入3片，每片上滴取5 μL提取液，將培養(yǎng)皿做好標(biāo)記分別放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑。通過抑菌圈直徑的大小來進(jìn)行條件的選擇[11-12]。

(2)液固比對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的實(shí)驗(yàn)。

(3)超聲波功率對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的實(shí)驗(yàn)。

超聲波功率分別為80 W、100 W、120 W、140 W、160 W，乙醇濃度60%、液固比101、超聲波時(shí)間40 min、超聲波溫度50 ℃，重復(fù)(1)的實(shí)驗(yàn)操作步驟。

(4)超聲波時(shí)間對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的實(shí)驗(yàn)。

超聲波時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，乙醇濃度60%、液固比101、超聲波功率120 W、超聲波溫度50 ℃，重復(fù)(1)的實(shí)驗(yàn)操作步驟。

(5)超聲波溫度對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的實(shí)驗(yàn)。

超聲波溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，乙醇濃度60%、液固比101、超聲波功率120 W、超聲波時(shí)間40 min，重復(fù)(1)的實(shí)驗(yàn)操作步驟。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，研究從香蕉皮中提取抑菌物質(zhì)的優(yōu)化工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1乙醇濃度對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響

乙醇濃度對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響見圖1。

由圖1可以看出：隨著乙醇濃度逐漸增大，抑菌圈直徑隨之增大，其中50%～60%的乙醇濃度使得抑菌圈直徑增速最明顯，濃度超過60%之后抑菌圈直徑呈現(xiàn)平緩趨勢。

一方面，抑菌物質(zhì)易溶解在乙醇中，隨著乙醇濃度的增加，抑菌產(chǎn)物的溶解度增加直至達(dá)到飽和；另一方面，在植物體內(nèi)抑菌物質(zhì)一部分以游離的形式存在于液泡中，一部分以與蛋白質(zhì)、多糖通過氫鍵或疏水鍵結(jié)合的形式存在于細(xì)胞壁中，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，會(huì)使蛋白質(zhì)變性，影響抑菌物質(zhì)的溶出，故將乙醇濃度設(shè)定為60%。

2.1.2 液固比對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響

液固比對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響見圖2。

圖2 液固比對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響

從圖2可知：隨著液固比逐漸增大，抑菌圈直徑先增加后減小，當(dāng)液固比達(dá)到61后抑菌圈直徑開始緩慢下降，說明抑菌物質(zhì)的溶出量已達(dá)飽和，此后再增加液固比，原料被試劑所飽和，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有顯著影響，從節(jié)約溶劑的角度考慮，將液固比定為61。

2.1.3 超聲波溫度對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響

超聲波溫度對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響見圖3。

圖3 超聲波溫度對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響

從圖3可知：隨著超聲波溫度的逐漸升高，抑菌圈直徑呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。一方面，隨著溫度的增加，分子運(yùn)動(dòng)速率加快，抑菌物質(zhì)的溶出隨之加快；但當(dāng)溫度超過一定值時(shí)，抑菌物質(zhì)會(huì)受到破壞，表現(xiàn)為抑菌效果減弱；另一方面，溫度升高，加快了溶劑的揮發(fā)，抑菌物質(zhì)的溶出量下降。當(dāng)超聲波溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大，故將超聲波溫度設(shè)定為40 ℃。

2.1.4 超聲波時(shí)間對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響

超聲波時(shí)間對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響見圖4。

圖4 超聲波時(shí)間對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響

從圖4可知：隨著超聲波處理時(shí)間的延長，抑菌圈直徑呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，即隨時(shí)間的延續(xù)，超聲波對物料的作用更加充分，從香蕉皮中提取的抑菌物質(zhì)含量也逐漸增大，當(dāng)超聲波時(shí)間為20 min時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到最大，之后再延長超聲時(shí)間會(huì)導(dǎo)致提取率逐漸下降，這可能是因?yàn)殚L時(shí)間超聲振動(dòng)使抑菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，此外超聲處理時(shí)間延長也會(huì)增加能耗，因此將超聲波時(shí)間設(shè)定為20 min。

2.1.5 超聲波功率對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響

超聲波功率對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響見圖5。

圖5 超聲波功率對香蕉皮中抑菌物質(zhì)提取的影響

從圖5可知：隨著超聲波功率的逐漸升高，抑菌圈直徑呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，說明隨著超聲波功率的逐漸升高從香蕉皮中提取的抑菌物質(zhì)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。

隨著超聲波功率的增強(qiáng)，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度增強(qiáng)，加快了抑菌物質(zhì)的溶出，但過高功率產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)會(huì)使抑菌物質(zhì)遭到破壞；同時(shí)，對于一定量的原料來說，較高的功率會(huì)造成“空超”現(xiàn)象，多余的功率消散在反應(yīng)液中增加了能耗，故將超聲波功率設(shè)定為100 W。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交分析軟件設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，正交實(shí)驗(yàn)均值見表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及其水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)均值表

通過表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可以看出：最佳的處理?xiàng)l件是A4B3C2D4E1，即當(dāng)乙醇濃度為80%，液固比為81，超聲波時(shí)間20 min，超聲波功率140 W，超聲波溫度30 ℃時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大，為9.23 mm。

由表3數(shù)據(jù)可以看出，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果最主要的因素是乙醇濃度，其次是超聲波功率，影響最小的是超聲波時(shí)間。

為確定最終的優(yōu)化工藝，對正交試驗(yàn)直觀結(jié)果和R值分析的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，具體操作如下：A4B3C2D4E1，即將80%的乙醇按照液固比81的比例與香蕉皮混合放在超聲波發(fā)生器中，設(shè)定超聲波功率140 W、超聲波溫度30℃反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束再經(jīng)350 W微波處理60 s后離心取上清液，按照1.2.1中的方法測量抑菌圈直徑。

A4B4C2D3E1，即將80%的乙醇按照液固比101的比例與香蕉皮混合放在超聲波發(fā)生器中，設(shè)定超聲波功率120 W、超聲波溫度30℃反應(yīng)20 min、，反應(yīng)結(jié)束再經(jīng)350 W微波處理60 s后離心取上清液，按照1.2.1中的方法測量抑菌圈直徑。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：A4B4C2D3E1與A4B3C2D4E1工藝下，抑菌圈直徑分別為9.28 mm和9.26 mm，即A4B4C2D3E1為提取的最優(yōu)工藝條件。

梁盛年，段志芳，方旺標(biāo)等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：香蕉皮中含有酚類、油脂類、有機(jī)酸、縮合鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖類等化學(xué)成分。為了進(jìn)一步探討香蕉皮抑菌的有效成分，利用丙酮提取香蕉皮中的鞣質(zhì)和酚性成分，用乙醚提取香蕉皮中的總有機(jī)酸，利用幾種常見細(xì)菌如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、金黃色葡萄球菌等菌種為供試菌做了初步抑菌試驗(yàn)(測量抑菌圈直徑的大小)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：香蕉皮中的主要抑菌成分是有機(jī)酸[13]。

有機(jī)酸能進(jìn)入大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)，降低細(xì)胞內(nèi)的pH值，影響參與代謝的相關(guān)酶的活性，進(jìn)而抑制大腸桿菌的生長，達(dá)到抑菌的目的[14]。Gong Y等的研究認(rèn)為有機(jī)酸可以與某些成分結(jié)合，如細(xì)胞膜上的脂多糖，導(dǎo)致細(xì)胞膜的穩(wěn)定性被破壞，進(jìn)而抑制大腸桿菌的生長[15]。

王虹玲等從香蕉皮中提取單寧的抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，單寧物質(zhì)對細(xì)菌的抑制作用較強(qiáng)，但是對霉菌抑制作用不太明顯，對酵母菌幾乎沒有抑制作用，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑制濃度(MIC)都為0.1%，對枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度(MIC)為0.2%，對黃曲霉、黑曲霉的最低抑制濃度(MIC)為1.0%，對啤酒酵母的最低抑制濃度(MIC)超過了1.0%[16]。

3 結(jié)論

以新鮮的香蕉皮為原料，通過超聲波-微波輔助方法提取香蕉皮中的抑菌物質(zhì)，主要分析了乙醇溶液濃度、液固比、超聲波溫度、超聲波時(shí)間以及超聲波功率等五個(gè)單因素對香蕉皮提取物抑菌效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：乙醇濃度為80%，液固比為101，超聲波時(shí)間20 min，超聲波功率120 W，超聲波溫度30 ℃時(shí)，抑菌圈直徑的平均值達(dá)到最大，為9.28 mm。

本實(shí)驗(yàn)提取的是多種成分的混合物，混合物間的相互作用以及抑菌物質(zhì)的有效濃度都會(huì)影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；此外，實(shí)驗(yàn)過程中，以抑菌圈為指標(biāo)評價(jià)提取物的抑菌效果，并不能表明從香蕉皮中提取抑菌物質(zhì)含量的多少，后續(xù)的研究應(yīng)對目的抑菌物質(zhì)進(jìn)行純化并選擇不同的菌群同時(shí)測定抑菌性能。