UPLC-QTOF-MS/ MS 對烏藥中阿樸菲類生物堿炮制前后差異的研究

佘 波 向星亮 時慶欣 金姝娜 張麗君 宋成武 蘇 超▲ 黃榮增▲

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430065

烏藥為樟科山胡椒屬植物烏藥Lindera aggregata(Sims) Kosterm 的干燥塊根[1]，氣香，味微苦、辛，有清涼感。有行氣止痛、溫腎散寒的功效，主要用于寒凝氣滯、遺尿尿頻、疝氣疼痛、經(jīng)寒腹痛[2]。烏藥中主要含有生物堿和萜類成分，其中阿樸菲類生物堿是烏藥生物堿中比例最高的種類。大量研究表明阿樸菲類生物堿具有多種藥理活性，包括抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、抗血小板凝結(jié)[5]、抗炎鎮(zhèn)痛[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]、抗瘧原蟲[8]等。

《博濟方》 記載炒制緩和辛散溫燥之性；《衛(wèi)生家寶產(chǎn)科備要》記載醋制引藥入肝，具有增強藥物引藥入肝，增強藥物溫通血脈，行經(jīng)止痛的作用；《普濟方》記載酒制增強溫散寒邪，行氣止痛，并引藥上行；《魏氏家藏方》記載鹽制引藥入腎，溫腎散寒等[9]。中藥炮制導(dǎo)致中藥化學(xué)成分的變化，是中藥藥性和功效改變的基礎(chǔ)，只有揭露炮制過程中化學(xué)成分的變化規(guī)律，才能闡明中藥炮制的機制[10]。本研究利用UPLC-QTOFMS/MS 分析技術(shù)考察不同炮制方法對烏藥中阿樸菲類生物堿的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters Xevo G2-XS QTOF 飛行時間質(zhì)譜儀(美國Waters 公司)；ACQUITY UPLC M-Class 液相色譜系統(tǒng)(美國Waters 公司)；Waters ACQUITY BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；KDC-140HR 高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；AT-201電子分析天平(d=0.01 mg，瑞士Mettler Toledo 公司)；5200H 型超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Milli-Q 型純水儀(美國Millipore 公司)

1.2 材料

烏藥飲片(亳州金芍堂中藥飲片有限公司，批號：190101，產(chǎn)地：江西樂平)經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為樟科植物烏藥Lindera aggregata (Sims)Kosterm 的干燥塊根；isonorboldine(去甲異波爾定)(上海源葉生物科技有限公司，批號：P10M9L61140，純度≥98.0%)；laurotetanine(六駁堿)(上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，批號：20200826，純度≥98.0%)；bulbocapnine(紫堇堿)(英國Carbosynth 生物科技有限公司，批號：FB65594，純度≥98.0%)；姜黃素(上海源葉生物科技有限公司，批號：R03D6S6966，純度≥98.0%)；甲醇(質(zhì)譜純，Thermo Fisher 公司)；甲酸(質(zhì)譜純，德國Merck 公司)；超純水(美國Millipore 公司)；黃酒(紹興圣御山酒業(yè)有限公司)；食鹽(湖北鹽業(yè)集團有限公司)；食醋(江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司)。

1.3 烏藥的炮制

1.3.1 炒烏藥 取等份烏藥100 g，置于鍋內(nèi)，用文火炒至深黃色，取出放涼[9]，粉碎(過80 目篩)。同法重復(fù)12 次，得到12 份炒烏藥。

1.3.2 醋烏藥 取等份烏藥100 g，加醋30 g 拌勻略悶，置鍋內(nèi)，用文火加熱，炒至微干，取出放涼[9]，粉碎(過80 目篩)。同法重復(fù)12 次，得到12 份醋烏藥。

1.3.3 酒烏藥 取等份烏藥100 g，加30 g 黃酒噴灑拌均，悶潤至酒被吸盡，置鍋內(nèi)，用文火加熱，炒至微干，取出放涼[9]，粉碎(過80 目篩)。同法重復(fù)12 次，得到12 份酒烏藥。

1.3.4 鹽烏藥 取等份烏藥100 g，加40 mL 5%鹽水拌勻，悶潤置鍋內(nèi)用文火炒至微黃色取出，放涼[9]，粉碎(過80 目篩)。同法重復(fù)12 次，得到12 份鹽烏藥。

1.4 供試品溶液的配制

分別取去甲異波爾定、六駁堿、紫堇堿對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成濃度100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。烏藥生品和以上炮制品粉末過80 目篩，分別取約0.1 g，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，甲醇定容，密塞，超聲30 min(100 kW，50 Hz)，取溶液適量14 000 r/min 離心10 min(轉(zhuǎn)子半徑7 cm)后取上清液，加入姜黃素內(nèi)標(biāo)液(終濃度100 ng/mL)，0.22 μm微孔濾膜濾過，分析待用。

1.5 UPLC-MS/MS 檢測條件

1.5.1 色譜條件 柱溫40℃；流動相A 為甲醇，B 為水；梯度洗脫：0.00～15.00 min，10%～40%A；15.01～18.00 min，40%～95%A；18.01～20.00 min，95%A；20.01～22.00 min，95%～10%A；22.01～25.00 min，10%A；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 采用ESI 離子源，正離子模式下采集數(shù)據(jù)；MSE模式采集一級和二級質(zhì)譜離子，采集范圍均為：m/z100～1200 Da；電噴霧電壓3000 V；錐孔電壓40 V；ESI 離子源溫度：100℃；脫溶劑溫度500℃；氣簾氣50 L/h；脫溶劑氣(N2)流速為600 L/h；一級碰撞能量：10 eV，二級碰撞能量：35 eV；碰撞能量波動±10 eV，以腦啡肽(m/z 556.2771)調(diào)諧液作為實時校正溶液。

1.6 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計

采用MassLynx V4.1 對UPLC-QTOF-MS/MS 數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)合Mass 值、參考文獻中的保留時間和分子式匹配軟件、對各主要分子離子峰進行歸屬，記錄阿樸菲類生物堿和內(nèi)標(biāo)的峰面積。

使用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，t 檢驗進行差異性統(tǒng)計。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 烏藥中阿樸菲類生物堿的表征

去甲異波爾定、六駁堿、紫堇堿為3 類典型性阿樸菲類生物堿，由于骨架結(jié)構(gòu)類似，均產(chǎn)生特征性m/z 177.0699 碎片離子。化合物3 的分子離子峰為[M+H]+為314.1420，計算出分子式為C18H19NO4，兩個苯環(huán)上的取代基為-OH 和-OCH3，先脫去一個NH3，可以直接脫去CH3·和CH3O·，最后可以脫去一個CO，出現(xiàn)二級特征離子[M+H-NH3]+和[M+H-NH3-CH3]+，此裂解行為和保留時間與A 類的標(biāo)準(zhǔn)品去甲異波爾定一致[11]；化合物21 的分子離子峰[M+H]+為342.1690，計算出分子式為C20H23NO4，裂解規(guī)律與去甲異波爾定類似，僅在甲氧基和羥基的數(shù)目不同[12]，此裂解行為和保留時間與B 類的標(biāo)準(zhǔn)品六駁堿一致[13]；C 類的阿樸菲類生物堿，與A 和B 類的不同在于存在亞甲二氧環(huán)橋，這種結(jié)構(gòu)比較特殊，化合物36 的分子量326.1389，計算出分子式為C19H19NO4，當(dāng)[M+H]+脫去NH2CH3之后，形成特征的[M+H-NH2CH3-CH3]+的子離子，再結(jié)合特征子離子[M+H-NH2CH3]+[14]，此裂解行為和保留時間與C 類的標(biāo)準(zhǔn)品紫堇堿一致[15]，見圖1。在烏藥生品和炮制品的混合樣品中，阿樸菲類生物堿化合物的輪廓譜見圖2(封三)。通過以上兩個主要步驟完成烏藥及其炮制品中的阿樸菲類生物堿的識別和表征，最終鑒別36 種阿樸菲類生物堿化合物。見表1。

表1 烏藥中36 種阿樸菲型生物堿類化合物

圖1 阿樸菲類生物堿圖特征性子離子

圖2 基于UPLC-QTOF-MS/MS 阿樸菲類生物堿特征輪廓譜(見內(nèi)文第10 頁)

2.2 炮制前后烏藥中阿樸菲類生物堿的變化

與生烏藥比較，經(jīng)炒制后，該類成分相對含量下降18 個，增加9 個；經(jīng)醋制后，相對含量下降21 個，增加6 個；經(jīng)酒制后，相對含量下降21 個，增加6 個；經(jīng)鹽制后，相對含量下降23 個，增加7 個。見圖3。

圖3 炮制后阿樸菲類生物堿相對含量的變化

在4 種炮制過程中，生物堿含量以降低為主，且大部分集中在A 類和C 類。有19 個化合物在4 種炮制過程中都發(fā)生明顯的變化，其中A 類中有8 個，占比57%，這8 個化合物在4 種炮制過程中的含量均減少。B 類中有3 個，占比43%，化合物16 與21 的含量在4 種炮制過程均減少，而化合物19 的含量在4 種炮制過程中均上升。C 類有8 個，占比53%，化合物25在4 種炮制過程中均增加，化合物28、29、34、35、36 在4 種炮制過程均降低。化合物26 在鹽制過程中基本消失殆盡，而在炒制、醋制、酒制過程中含量均顯著升高；化合物32 在酒制和鹽制過程中消失殆盡；化合物18 在4 種炮制過程中均沒有發(fā)生明顯地變化，比較穩(wěn)定。

3 討論

天然產(chǎn)物中同分異構(gòu)體眾多，烏藥中阿樸菲類生物堿也有較多的同分異構(gòu)體[16]，具有相同的骨架結(jié)構(gòu)，所以具有共有的特征離子，結(jié)合其他的特征離子[17]，可以對烏藥中阿樸菲類生物堿加以區(qū)分。中藥的炮制過程對中藥的影響復(fù)雜，藥材中化學(xué)成分的種類、數(shù)量和比例的變化可能是其不同功能和藥理作用的原因[18]。

中藥炮制過程中引起組分結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)變化[19]，炮制后，與生烏藥比較，大部分生物堿含量變化有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。荷葉中生物堿大部分為阿樸菲類生物堿，檢驗荷葉炒碳過程中升華物的成分，鑒別出5 種生物堿，經(jīng)過炒碳之后，總生物堿含量下降，是生物堿升華的結(jié)果[20]。阿樸菲類生物堿遇熱不穩(wěn)定，容易升華降解，而烏藥的4 種炮制過程都經(jīng)過炒制，推測可能在炮制過程中升華，導(dǎo)致生物堿含量降低。同時有研究顯示厚樸經(jīng)炮制后，厚樸中的阿樸菲類生物堿和芐基異喹啉類生物堿含量均顯著下降[21]。炒烏藥緩和辛散溫燥之性，可能與其中生物堿含量的下降有關(guān)。阿樸菲類生物堿的毒性與亞甲二氧環(huán)橋及N-甲基的取代有關(guān)[22]，阿樸菲類生物堿對癌癥細胞和正常細胞都有殺傷作用[23]。炮制之后化合物蓮葉桐堿的含量下降，可明顯降低細胞毒性。而少數(shù)生物堿的含量上升，可能是炮制過程中導(dǎo)致生物堿構(gòu)型的轉(zhuǎn)化，或者一些糖苷型生物堿的降解[24]。同時烏藥為塊根，質(zhì)地堅硬，炮制后粉碎，有利于溶媒的進入，也有可能更利于有效成分生物堿的煎出[25-26]。

本研究初步闡明了烏藥炮制前后阿樸菲類生物堿的變化規(guī)律，為烏藥炮制工藝優(yōu)化，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了科學(xué)依據(jù)。