60Co-γ射線輻照滅菌升降茶適用性研究

劉 菊，白明學(xué)*，張紅偉，呂 鵬，高曉潔，侯 超

(1 鄭州市中醫(yī)院，鄭州 450007；2 河南省食品藥品檢驗(yàn)所/國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450018)

升降茶源于升降散(出自《傷寒溫疫條辨》)，由大黃、姜黃、僵蠶、蟬蛻4味中藥組成，具有升清降濁、散風(fēng)清熱之功；主治溫病表里三焦大熱；癥見低熱或未發(fā)熱、干咳、少痰、咽干咽痛、倦怠乏力、胸悶、脘痞或嘔惡、便溏等。升降茶制備工藝簡單易行，經(jīng)粉碎、制粒、干燥、分劑量包裝，用熱水浸泡或稍煎取汁服用，滅菌控制至關(guān)重要。60Co-γ射線滅菌穿透力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)、安全，且滅菌效果徹底，尤其適宜含揮發(fā)性成分藥材或制劑，對(duì)藥品質(zhì)量影響較小，已廣泛應(yīng)用于中藥滅菌領(lǐng)域[1-4]。為確定升降茶輻照滅菌最佳劑量，確保藥品質(zhì)量不被破壞且達(dá)到滅菌效果，保障臨床用藥安全有效，本研究開展60Co-γ射線滅菌適用性研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A液相色譜儀(日本島津公司)；DM3000電子顯微鏡(德國徠卡儀器公司)；三用紫外分析儀(上?？等A生化儀器制造有限公司)；GDH-9625A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海塞歐試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；JA2003N電子天平(上海菁海儀器設(shè)備有限公司)；AB265-5電子天平(d=0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司)；超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；DZKW-4恒溫水浴鍋(河南天帝電子科技有限公司)；霉菌培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司)；CLHN恒溫恒濕培養(yǎng)箱(天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；電熱恒濕培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.2 對(duì)照品

姜黃素(批號(hào)110823-201706，含量98.7%)、蘆薈大黃素(批號(hào)110795-201007，含量98.0%)、大黃酸(批號(hào)110757-201607，含量99.3%)、大黃素(批號(hào)110756-201913，含量96.0%)、大黃酚(批號(hào)110796-201922，含量99.4%)、大黃素甲醚(批號(hào)110758-201415，含量99.1%)、大黃對(duì)照藥材(批號(hào)120984-201202)，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 試藥

升降茶(鄭州市中醫(yī)院，豫藥制備字Z20200020000，批號(hào)200125)。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào)20180823)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)20180910)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào)20180626)、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基(批號(hào)20180915)，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)180518)、腸道增菌液體培養(yǎng)基(批號(hào)180813)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)180627)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)180412)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)171211)，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組與試驗(yàn)

取升降茶40盒，分成空白組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10盒。低、中、高劑量組分別按4、6、8 kGy劑量進(jìn)行輻照滅菌。滅菌后，根據(jù)《升降茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(草案)》進(jìn)行性狀、鑒別(顯微鑒別、薄層色譜鑒別)、檢查(水分、微生物限度)、含量測(cè)定(姜黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)質(zhì)量比對(duì)分析研究[5-8]。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.3 質(zhì)量指標(biāo)分析測(cè)定

2.3.1性狀

取4組供試品適量，置白紙上，目視觀察色澤，鼻嗅氣味，開水沖泡口嘗味道。結(jié)果：滅菌前和滅菌后，4組性狀均為黃棕色的藥材粗粉及顆粒；氣清香，味微苦。見表1。

表1 不同劑量60Co-γ射線輻照滅菌對(duì)升降茶水分、性狀的影響

2.3.2水分測(cè)定

取供試品適量，按《中國藥典》2015年版四部通則0832項(xiàng)下方法[9]測(cè)定4組供試品水分。結(jié)果：不同劑量輻照滅菌對(duì)升降茶水分無明顯影響(RSD%<2)。見表1。

2.3.3顯微鑒別

取4組供試品適量，研碎，過四號(hào)篩，取粉末，置顯微鏡下觀察。結(jié)果：表皮組織表面具網(wǎng)格樣皺縮紋理以及紋理突起形成的小尖突，有圓形毛窩，邊緣黃色(炒僵蠶)。草酸鈣簇晶直徑20～160 μm，有的達(dá)190 μm(大黃)?？瞻捉M顯微特征見圖1，不同劑量輻照滅菌后，大黃草酸鈣簇晶、僵蠶表皮組織特征仍清晰可見，無明顯影響。

圖1 升降茶(空白組)顯微特征圖

2.3.4薄層色譜鑒別

分別取4組供試品0.5 g，加甲醇40 ml，浸泡0.5 h，濾過，取濾液10 ml，蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，再加鹽酸2 ml，水浴加熱35 min，冷卻，用乙醚萃取2次，每次20 ml，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? ml使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述2種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果：不同劑量輻照后的供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)。見圖2和圖3。

1：大黃對(duì)照藥材；2～4：空白組供試品圖2 升降茶(空白組)大黃薄層色譜鑒別圖

1～3：高、中、低劑量組供試品；4：大黃對(duì)照藥材圖3 升降茶(高、中、低劑量組)大黃薄層色譜鑒別圖

2.3.5微生物限度檢查

分別取4組供試品適量，按《中國藥典》2015年版四部通則1105和1106項(xiàng)下方法[10]測(cè)定需氧菌總數(shù)、霉菌酵母菌總數(shù)，并運(yùn)用SPSS 20.0(t檢驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較高、中、低劑量組與空白組是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；檢查大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌、沙門菌。結(jié)果：當(dāng)輻照劑量大于或等于6 kGy(中劑量)時(shí)，需氧菌總數(shù)、霉菌酵母菌總數(shù)與空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，符合《中國藥典》2015年版規(guī)定，且各控制菌為陰性，說明滅菌符合規(guī)定。見表2和圖4。

表2 不同劑量60Co-γ射線輻照滅菌對(duì)升降茶微生物限度的影響

圖4 不同劑量60Co-γ射線輻照對(duì)升降茶需氧菌總數(shù)、霉菌酵母菌總數(shù)的影響

2.3.6姜黃素、5種蒽醌成分含量測(cè)定[11-12]

2.3.6.1 色譜條件 色譜柱Phenomenex Lune C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測(cè)波長為254 nm，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(82∶18)，流速1.0 ml/min，柱溫25 ℃。

2.3.6.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取姜黃素、5種蒽醌(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)適量，加甲醇溶解稀釋制成每1 ml含420.3 μg姜黃素、31.3 μg蘆薈大黃素、167.7 μg大黃酸、49.5 μg大黃素、32.7 μg大黃酚、105.9 μg大黃素甲醚的混合對(duì)照品母液。精密吸取對(duì)照品母液1 ml，加甲醇稀釋至10 ml，得混合對(duì)照品溶液。

2.3.6.3 供試品溶液制備 分別取4組供試品0.25 g，加甲醇25 ml，精密稱定，超聲35 min，用甲醇補(bǔ)足重量，過濾，取濾液5 ml揮干，加10%鹽酸溶液20 ml，超聲水解5 min，再加三氯甲烷10 ml，置分液漏斗中，超聲35 min，分取三氯甲烷層，水層再用三氯甲烷萃取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷萃取液，回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.6.4 系統(tǒng)性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液按“2.3.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，理論板數(shù)按姜黃素峰計(jì)不低于4000，分離度大于1.5，得色譜分離圖。見圖5。

1：姜黃素；2：蘆薈大黃素；3：大黃酸；4：大黃素；5：大黃酚；6：大黃素甲醚圖5 升降茶含量測(cè)定色譜圖

2.3.6.5 供試品測(cè)定 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果：當(dāng)輻照劑量為6 kGy(中劑量)時(shí)，姜黃素、總蒽醌含量稍有下降，但與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；當(dāng)劑量增大到8 kGy(高劑量)時(shí)，姜黃素、5種蒽醌含量下降，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明輻照劑量增加會(huì)降低主成分含量，故最佳輻照劑量為6 kGy，既殺滅微生物、滅菌完全，又保證了樣品的質(zhì)量穩(wěn)定。見表3、表4和圖6、圖7。

表3 不同劑量60Co-γ射線輻照滅菌對(duì)升降茶中姜黃素含量的影響

表4 不同劑量60Co-γ射線輻照滅菌對(duì)升降茶中5種蒽醌成分含量的影響

圖6 不同劑量60Co-γ 射線輻照對(duì)姜黃素含量的影響

圖7 不同劑量60Co-γ 射線輻照對(duì)總蒽醌(5種蒽醌)含量的影響

3 討論

60Co-γ射線輻照滅菌穿透力強(qiáng)，可以不破壞包裝而殺死藥品中的微生物，安全經(jīng)濟(jì)，耗能低，滅菌徹底，無殘留，不產(chǎn)生感生放射性和熱量，尤其適宜熱敏性物料及揮發(fā)性成分的滅菌操作，因此近年來在中藥飲片、中成藥、中藥制劑生產(chǎn)中應(yīng)用越來越廣泛[13]。但滅菌過程中普遍存在輻照劑量高、重復(fù)輻照、有效成分損失等問題。本研究對(duì)升降茶輻照劑量進(jìn)行考察，旨在篩選出既保證制劑質(zhì)量穩(wěn)定、不破壞有效成分，又達(dá)到滅菌效果的合理劑量。

前期研究已建立升降茶中姜黃素、5種蒽醌類成分含量同步測(cè)定的方法，并已驗(yàn)證方法學(xué)，本研究基于此條件開展含量測(cè)定。為確保數(shù)據(jù)的靈敏度與精確性，便于統(tǒng)計(jì)對(duì)比分析，本研究需氧菌總數(shù)、霉菌酵母菌總數(shù)未進(jìn)行兩位數(shù)修約，直接采用原始數(shù)據(jù)。

原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》(2015年版)建議盡可能采用低劑量輻照滅菌，中藥最大總體平均輻照劑量原則上不超過10 kGy；并且需要通過一定的研究工作，考察和評(píng)估輻照滅菌對(duì)中藥安全性、有效性及質(zhì)量穩(wěn)定性的影響。因此本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇4～8 kGy劑量進(jìn)行研究。

升降茶經(jīng)6 kGy的60Co-γ射線輻照，既殺滅微生物，滅菌符合規(guī)定，且樣品性狀、顯微特征、薄層色譜無變化，水分無明顯影響(RSD%<2)，主成分(姜黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，質(zhì)量總體無明顯變化。綜上所述，60Co-γ輻照可用于升降茶的滅菌，最佳輻照劑量為6 kGy，保障了升降茶臨床用藥安全有效。