毛細(xì)管超速離心技術(shù)在體外預(yù)測(cè)大量胎母輸血綜合征的研究*

張?jiān)辞?王美茹 徐璐 馬怡然 楊融輝 郝一文 程大也 叢桂敏

胎母輸血綜合征（fetomaternal hemorrhage，F(xiàn)MH）是指各種不同原因所致一定量的胎兒血液通過(guò)破損的胎盤屏障或絨毛間隙進(jìn)入母體血液循環(huán)，引發(fā)一系列不同程度胎兒失血、貧血及新生兒溶血病和母體溶血性輸血反應(yīng)等臨床癥候群，也是非免疫性胎兒水腫的主要發(fā)病原因之一[1]。文獻(xiàn)報(bào)道約93%孕產(chǎn)婦可能發(fā)生（失血量＜0.5 mL）胎母輸血綜合征，其中失血量＞30 mL的孕婦發(fā)生率為0.3%[2]。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)大量胎母輸血綜合征明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，ALMEIDA[3]認(rèn)為胎兒出血量超過(guò)80 mL就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的胎兒貧血，即可定義為大量胎母輸血。SAMADI[4]認(rèn)為出血量超過(guò)100 mL，會(huì)發(fā)生胎兒死亡。還有作者認(rèn)為胎兒向母體輸送血液超過(guò)150 mL[5]，為大量胎母輸血。圍產(chǎn)兒死亡率達(dá)31%～50%，約13%的死亡與FMH相關(guān)，其中約5%的死胎是大量FMH造成的，多為FMH晚期的臨床表現(xiàn)[6]。因此，大量胎母輸血綜合征的治療關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早監(jiān)測(cè)。目前常用診斷胎FMH的方法有：流式細(xì)胞術(shù)、酸洗脫實(shí)驗(yàn)、HbF胎兒血紅蛋白測(cè)定。為了診斷和定量胎兒出血量，酸洗脫實(shí)驗(yàn)（KB實(shí)驗(yàn)）是最常見(jiàn)的篩查方式，流式細(xì)胞術(shù)是胎母輸血綜合征的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但這兩種方法需要配備專業(yè)的儀器和設(shè)備，價(jià)格昂貴且操作時(shí)間長(zhǎng)需要專業(yè)人員操作，專業(yè)操作嚴(yán)格，尚未在臨床廣泛開(kāi)展。因此，為了改善母嬰妊娠結(jié)局，本研究通過(guò)體外模擬胎母輸血綜合征的血標(biāo)本特點(diǎn)，將O型非妊娠全血輸入非O型臍帶血，運(yùn)用毛細(xì)管分離技術(shù)檢測(cè)胎兒紅胞A或B抗原，旨在評(píng)估毛細(xì)管超速離心技術(shù)在ABO血型不一致的大量胎母輸血的臨床檢測(cè)限及檢出率，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1 標(biāo)本來(lái)源 母體模擬血液標(biāo)本：采集O型育齡期非妊娠期健康女性捐獻(xiàn)者靜脈全血2 mL，以EDTA-K2抗凝；胎兒模擬血液標(biāo)本：A和B型新生兒臍帶血，EDTA-K2抗凝。

2 試劑及儀器 抗A、B單克隆抗體（批號(hào)：20201216）為上海血液生物醫(yī)藥有限公司提供，HbF-GITC單克隆抗體（552829），為BD Biosciences公司；湘儀L550型離心機(jī)、Baso 2005-1型離心機(jī)、Diana配套孵育器及毛細(xì)管醫(yī)用超速離心機(jī)等、生物顯微鏡（CX23LEDRFS1C）、ARIA2流式儀。

3 方法

3.1 胎母輸血綜合征模擬樣本懸液的制備：取O型育齡期非妊娠健康女性捐獻(xiàn)者EDTA-K2抗凝血2 mL分別與8.57 μL、11.4 μL、14.2 μL、17.14 μL、28.57 μL A或B型臍帶血，按孕中后期孕婦血容量為7 000 mL（一般成人血容量在5 000 mL左右，孕中后期血液循環(huán)增加1～2 L[7]）發(fā)生了40、50、60、70、100 mL胎母輸血綜合的比例，同一個(gè)比例樣本制備重復(fù)20次，室溫下混合后孵育1小時(shí)期間并用震蕩儀使其處在混勻狀態(tài)。

3.2 胎母出血模擬樣本懸液中胎兒細(xì)胞比例的檢測(cè)：嚴(yán)格按照FITC-HbF單克隆抗體試劑說(shuō)明書，以FITC標(biāo)記的抗HbF抗體標(biāo)記胎兒細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)胎兒細(xì)胞百分比。實(shí)驗(yàn)同步以5%臍血的EDTA抗凝血分別加或不加單克隆抗體做陽(yáng)性和陰性對(duì)照進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.3 胎母出血模擬樣本懸液用毛細(xì)管離心技術(shù)分離胎兒細(xì)胞：按2018版AABB技術(shù)手冊(cè)[8]操作流程，將制備好模擬胎母輸血綜合征血樣本用生理鹽水洗滌三次，最后一次用1 000×g離心5 min，盡可能去掉上清后混勻。將洗滌后RBC吸出后混勻，加入1～2根比積管中，留出5 mm長(zhǎng)度封口用。從血液加入端用橡皮泥封死管底，擠出的血液用紗布吸走。放入帶有編號(hào)的離心槽，注意平衡，擰緊內(nèi)蓋，關(guān)上離心機(jī)外蓋10 000 r/min離心15～20 min。在距紅細(xì)胞柱頂（遠(yuǎn)心端）5 mm處切開(kāi)微量紅細(xì)胞比積管，此段紅細(xì)胞主要為胎兒紅細(xì)胞，見(jiàn)圖6～8；在距紅細(xì)胞柱底（近心端）5 mm處切開(kāi)微量紅細(xì)胞比積管，此段紅細(xì)胞主要為母體新鮮紅細(xì)胞。

3.4 試管法檢測(cè)近心端、遠(yuǎn)心端紅細(xì)胞ABO血型抗原：分別將近心端、遠(yuǎn)心端切開(kāi)的紅細(xì)胞比積管用生理鹽水洗滌三次，按照《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》[9]進(jìn)行試管法紅細(xì)胞ABO系統(tǒng)血型鑒定。近心端紅細(xì)胞ABO血型鑒定結(jié)果為O型，遠(yuǎn)心端紅細(xì)胞ABO血型鑒定結(jié)果與臍帶血標(biāo)本中的紅細(xì)胞血型一致時(shí)證明毛細(xì)管超速離心技術(shù)分離成功。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用prism8.0進(jìn)行作圖，運(yùn)用診斷實(shí)驗(yàn)性指標(biāo)進(jìn)行診斷試驗(yàn)的分析與評(píng)價(jià)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胎母輸血出血量達(dá)40 mL、50 mL、60 mL、100 mL時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如下圖1，遠(yuǎn)心端模擬胎兒的A或B抗原的鏡下凝集圖如圖2。

圖1 模擬不同F(xiàn)MH出血量對(duì)應(yīng)的流式圖

圖2 模擬FMH毛細(xì)血管離心后遠(yuǎn)心端A（B）試管法鏡下凝集

2 當(dāng)胎母輸血量達(dá)到60 mL時(shí)，靈敏度為0.8，特異度為0.95，符合率為0.875，約登指數(shù)為0.75最接近1，診斷價(jià)值較大。見(jiàn)表1。

3 ROC曲線下面積診斷價(jià)值判斷 當(dāng)模擬胎母輸血為50 mL、60 mL、100 mL時(shí)，ROC曲線下面積分別為0.725、0.875、0.850，均P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此時(shí)用毛細(xì)管離心技術(shù)診斷胎母輸血綜合征具有診斷價(jià)值。見(jiàn)表2、圖3。

圖3 毛細(xì)血管離心技術(shù)診斷不同出血量FMH的ROC曲線分析

表2 ROC曲線下面積

4 臨床病例運(yùn)用 選取了兩例臨床高度懷疑發(fā)生FMH的O型產(chǎn)婦，用毛細(xì)管超速離心技術(shù)進(jìn)行診斷，如圖4。

圖4 臨床病例毛細(xì)血管離心技術(shù)分離后遠(yuǎn)心端結(jié)果

討 論

胎母輸血綜合征可以發(fā)生在妊娠的各個(gè)時(shí)期，孕婦早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)、機(jī)體尚可代償，一旦臨床出現(xiàn)典型三聯(lián)征表現(xiàn)（胎動(dòng)減少或消失、胎心監(jiān)護(hù)正弦波、胎兒水腫）提示胎兒出血已經(jīng)非常嚴(yán)重。大量胎母輸血綜合征是一種罕見(jiàn)但有時(shí)候會(huì)危及生命的事件[10]。有研究報(bào)道胎兒在母體內(nèi)短期發(fā)生大量出血可導(dǎo)致胎動(dòng)頻繁、血液大量流失，嚴(yán)重的可能發(fā)生胎兒出生后新生兒Apgar評(píng)分低、肌張力低、新生兒呼吸困難甚至窒息、胎死宮內(nèi)等缺氧的臨床表現(xiàn)[11,12]。

目前胎母輸血綜合征的診斷方式有流式細(xì)胞術(shù)、酸洗脫實(shí)驗(yàn)、胎兒血紅蛋白HbF測(cè)定等。流式細(xì)胞術(shù)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但大多數(shù)醫(yī)院缺乏相關(guān)大型檢測(cè)設(shè)備，并缺乏專業(yè)技術(shù)人員操作；酸洗脫實(shí)驗(yàn)是目前最普遍的篩查方式，但假陽(yáng)性和假陰性率高；胎兒HbF測(cè)定多用于科研，臨床上均難以廣泛開(kāi)展。因此，想借用輸血科異體紅細(xì)胞分離的毛細(xì)管超速離心技術(shù)，該方法簡(jiǎn)便、易操作，不需要特殊試劑和復(fù)雜的操作，即可實(shí)驗(yàn)診斷大量胎母輸血綜合征。毛細(xì)管超速離心是根據(jù)受檢者新舊輸入紅細(xì)胞的比重不同進(jìn)行分層的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)[13]。毛細(xì)管直徑小、長(zhǎng)度大，在超速離心力作用下，有密度梯度區(qū)間能進(jìn)行新舊細(xì)胞的分離。FMH孕婦自體新生的紅細(xì)胞比重較小，集中在毛細(xì)管的近心端；通過(guò)破損胎盤反復(fù)輸入母體的紅細(xì)胞在老化過(guò)程中產(chǎn)生囊泡、膜逐漸丟失而比重不斷加大，離心后集中在毛細(xì)管遠(yuǎn)心端[14]。

本研究通過(guò)模擬FMH發(fā)生出血的比例，在體外建立胎母輸血綜合征的模型，并嘗試用毛細(xì)管超速離心技術(shù)進(jìn)行分離胎母ABO血型不一致的胎兒紅細(xì)胞。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)胎兒出血量超過(guò)50 mL時(shí)，毛細(xì)管離心技術(shù)有較大的的診斷價(jià)值（ROC曲線下面積均＞0.725），其中胎母輸血量為60 mL和100 mL時(shí)的約登指數(shù)均＞0.7，最接近于1，此時(shí)診斷價(jià)值最大。通過(guò)不同濃度梯度的FMH模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)胎母輸血量越大時(shí)，特別是發(fā)生大量胎母輸血（≥50 mL）時(shí)，毛細(xì)管超速離心技術(shù)對(duì)胎母輸血綜合征的篩查價(jià)值更大。通過(guò)20例陰性的對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該診斷試驗(yàn)的特異度為0.95，即排除了亞型和疾病原因?qū)е碌目乖瓬p弱等出現(xiàn)假陰性外，誤診率較低。因此，毛細(xì)管離心技術(shù)對(duì)于ABO血型不一致的大量FMH（≥50 mL）的初篩具有較高的靈敏度和特異度。此外，毛細(xì)管超速離心技術(shù)還有操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉和創(chuàng)傷小等特點(diǎn)。

FMH診斷胎兒失血量目前國(guó)內(nèi)外尚未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，其臨床的發(fā)生概率根據(jù)胎兒失血量的不同而不同。關(guān)于大量胎母輸血綜合征的定義從30 mL到150 mL不等，有學(xué)者將大量FMH的臨界值定義為30 mL，對(duì)Rh陰性母親在生育Rh陽(yáng)性胎兒時(shí)預(yù)防性使用抗D免疫球蛋白的劑量有臨床意義[15]。將出血閾值定義為80 mL和150 mL時(shí)，其FMH的發(fā)生率分別為1/1 000和1/5 000[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道5%的死胎是由于大量胎母輸血造成的，通過(guò)孕期的主動(dòng)監(jiān)測(cè)、及時(shí)發(fā)現(xiàn)可疑的高危孕產(chǎn)可以改善圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦的生命安全[6]。本實(shí)驗(yàn)研究的毛細(xì)管超速離心法識(shí)別胎母輸血綜合征的閾值為50 mL，可以識(shí)別出部分需要進(jìn)行抗D免疫球蛋白預(yù)防的孕婦，可以識(shí)別出胎母輸血閾值定義為80 mL以上的已發(fā)生胎母輸血的孕婦，這就圍產(chǎn)期預(yù)防RhD免疫、減少或預(yù)防胎兒及新生兒不良預(yù)后有一定的臨床意義。

我們?cè)趯?shí)際臨床工作中發(fā)現(xiàn)2例用毛細(xì)管超速離心技術(shù)診斷胎母輸血綜合征的病例。病例一：?jiǎn)棠常?5歲，G2P0，O型RhD陽(yáng)性，妊娠35+5周，妊娠合并慢性高血壓，胎兒宮內(nèi)窘迫，以“胎心監(jiān)護(hù)異常1天”入院，完善相關(guān)檢查后次日進(jìn)行剖宮產(chǎn)手術(shù)分娩一2 750 g活嬰，一分鐘apar評(píng)分8分，5分鐘10分。因胎兒膽紅素超正常值2倍，新生兒溶血三項(xiàng)試驗(yàn)陽(yáng)性，血型A型。病例二：孫某，30歲，G3P1，O型RhD陽(yáng)性，丈夫血型為B型，妊娠30+4周，完全性前置胎盤，妊娠期糖尿病，先兆早產(chǎn)，因“自覺(jué)胎動(dòng)減少，胎心監(jiān)護(hù)異常2天” 入院。入院后期待療法，密切進(jìn)行胎心監(jiān)護(hù)，待胎兒成熟后擇期進(jìn)行剖宮產(chǎn)。對(duì)這兩例產(chǎn)婦的血進(jìn)行毛細(xì)管離心技術(shù)，分別在案例一和案例二的遠(yuǎn)心端在反復(fù)離心后發(fā)現(xiàn)A細(xì)胞和B細(xì)胞鏡下凝集。

綜上所述，毛細(xì)管超速離心技術(shù)作為輸血科異體紅細(xì)胞分離的一種方法，在孕婦產(chǎn)前常規(guī)血型鑒定已知、排除ABO亞型及抗原表達(dá)異常的弱A弱B等情況下，若在妊娠中后期用毛細(xì)管分離發(fā)現(xiàn)母體存在大量ABO異型紅細(xì)胞時(shí)，可以作為大量胎母輸血綜合征的一個(gè)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道胎母出血量為30 mL的發(fā)病率為3/1 000[3]，但由于臨床對(duì)其認(rèn)識(shí)不足、檢測(cè)方法受限，仍存在大量流產(chǎn)和胎死宮內(nèi)的病例臨床未報(bào)道，F(xiàn)MH實(shí)際發(fā)生率可能要高于這個(gè)比例。本文是利用毛細(xì)管超速離心技術(shù)篩選胎母輸血征的實(shí)驗(yàn)研究，旨在摸索一個(gè)不需要昂貴設(shè)備及試劑的簡(jiǎn)單易行的可在臨床常規(guī)開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)方法。我們?cè)贔MH的模型運(yùn)用毛細(xì)管超速離心法，后期會(huì)繼續(xù)收集高危孕婦病例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)僅完成了以O(shè)型孕產(chǎn)婦通過(guò)毛細(xì)管超速分離技術(shù)檢測(cè)出A或B紅細(xì)胞來(lái)篩查胎母輸血的情況。對(duì)于A型或B型孕婦與B型或A型胎兒之間的胎母輸血的篩查敏感度和特異度有待于今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突