基于網(wǎng)絡藥理學探討荔枝核抗炎作用機制

李玉鳳，丁世磊，趙立春,2※

(1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西 南寧 530200)

炎癥是在宿主系統(tǒng)受到病理刺激時機體所呈現(xiàn)出的各種保護性免疫應答，是人類疾病中最為常見的病理過程，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展；目前臨床上常用的抗炎藥物有非甾體類抗炎藥和甾體類抗炎藥，而該類藥物具有一定的副作用，長期服用可能會損害機體[1]。因此，新型抗炎藥物的研發(fā)已成為目前國內(nèi)外研究的一個熱點。

荔枝核（Litchi Semen seed）為無患子科植物荔枝（Litchi chinensis Sonn）的干燥成熟種子，其性溫，味甘、微苦，歸肝、腎經(jīng)，具有行氣散結、祛寒止痛的功效[2]，主要分布于亞熱帶和熱帶地區(qū)[3,4]。荔枝核作為一味傳統(tǒng)的中藥材，在歷代中國藥典上均有記載。研究發(fā)現(xiàn)荔枝核含有復雜的化學成分，主要為黃酮類、皂苷類、甾體類、氨基酸、糖類及微量元素等，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒、抗肝纖維化和降血糖等藥理活性，常用于治療睪丸炎、腫瘤、肝臟疾患、糖尿病和老年癡呆等[5-10]。

網(wǎng)絡藥理學結合整體性與系統(tǒng)性的特點，作為一門新興的藥理學分支學科，主要通過現(xiàn)代信息手段（如生物學、統(tǒng)計學和計算機科學等）分析單味中藥或者中藥復方“多成分”、“多靶點”的作用特點，通過構建“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖進一步闡明荔枝核藥效物質基礎及分子作用機制[11,12]?；诖?，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法從分子、細胞及組織等不同水平探討荔枝核發(fā)揮抗炎作用的活性成分、關鍵靶點及其通路之間的作用關系，從而為荔枝核的新藥研究與開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）；毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database,CTD）（http://ctdbase.org/）；全球蛋白質資源數(shù)據(jù)庫（Universal Protein，Uniprot）（https://www.uniprot.org/）；生物信息在線工具韋恩Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；蛋白質相互作用數(shù)據(jù)庫String（https://string-db.org/）；基因富集分析的在線工具（WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit,WebGestalt）（http://www.webgestalt.org/）；Cytoscape 3.8.0軟件。

1.2 荔枝核活性成分的篩選

以口服生物利用度（oral bioavilability,OB）≥30%、類藥性（drug likeness,DL）≥0.18為篩選原則，篩選出符合條件的荔枝核活性成分，進一步通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取與活性成分相對應的靶點蛋白，去除重復的靶點蛋白[13,14]。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對上述的靶點蛋白進行標準化，獲取相對應的基因名。

1.3 疾病相關靶點篩選

以“inflammation”為關鍵詞，在CTD數(shù)據(jù)庫中搜索炎癥相關基因[15]，去重后，得到炎癥相關基因。將1.2項下檢索到的荔枝核活性成分基因與炎癥基因導入Venny2.1中，取其交集，在線制作韋恩圖，得到共同靶基因，即為荔枝核潛在的抗炎靶點基因。

1.4 構建蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡分析

將1.3項下獲取的共同靶基因所對應的靶蛋白上傳到String數(shù)據(jù)庫中[16]進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction,PPI）網(wǎng)絡分析，將結果以T SV格式輸出，導入Cytoscape 3.8.0軟件中構建蛋PPI網(wǎng)絡圖，并進行拓撲分析，獲取荔枝核抗炎的關鍵靶蛋白。

1.5 構建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡并分析

將1.4項下的關鍵靶蛋白與荔枝核相對應的活性成分上傳至Cytoscape 3.8.0軟件，構建荔枝核活性成分-靶點網(wǎng)絡圖并進行拓撲分析。

1.6 GO分析和KEGG通路富集分析

將1.4項下的關鍵蛋白導入WebGestalt在線數(shù)據(jù)庫進行基因本體（Gene Ontology,GO）分析以及京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析[17]，以顯著性P＜0.05、FDR＜0.05為閾值，進行荔枝核抗炎相關的靶點蛋白在生物功能和信號通路中的富集分析，得到GO柱狀圖和KEGG信號通路柱狀圖。采用Cytoscape軟件構建“關鍵活性成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡圖。

2 結果

2.1 荔枝核活性成分的篩選

經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索獲得72種荔枝核化學成分，通過OB≥30%、DL≥0.18進行篩選，獲得荔枝核的活性成分8個，去除無靶點化合物，最終得到7個活性成分，具體信息見表1。通過TCMSP檢索活性成分所對應的蛋白靶點，結合Uniprot數(shù)據(jù)以“Homo sapiens”為篩選條件，獲取靶點蛋白的基因名，去除重復項，共得到荔枝核活性成分作用靶點基因178個。

表1 荔枝核中主要活性成分Table 1 Main active components in seeds

表1 荔枝核中主要活性成分Table 1 Main active components in seeds

類藥性Drug likeness MOL001494 Mandenol 42.00 0.19 MOL002883 Ethyl oleate(NF) 32.4 0.19 MOL000358 beta-sitosterol 36.91 0.75 MOL000359 sitosterol 36.91 0.75 MOL000449 Stigmasterol 43.83 0.76 MOL000073 ent-Epicatechin 48.96 0.24 MOL000098 quercetin 46.43 0.28標識TCMSP ID化合物Compounds口服生物利用度（%）Oral bioavailabilities

2.2 疾病相關靶點篩選

經(jīng)CTD數(shù)據(jù)庫檢索，去除重復項，得到43 491個炎癥相關靶點基因，將上述獲得的荔枝核活性成分靶點基因與炎癥靶點基因通過Venny2.1進行映射，繪制韋恩圖，獲取共同靶點基因162個，見圖1，提示該162個靶點為荔枝核潛在的抗炎靶點。

圖1 荔枝核的成分靶點與炎癥相關靶點的韋恩圖Fig.1 Venn plot of compositional targets and inflammation-related targets in seeds

2.3 構建蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡

將上述的共同靶點基因所對應的靶蛋白上傳到String數(shù)據(jù)庫中，預測蛋白質-蛋白質相互作用關系。以中等置信度＞0.4為篩選條件[18]，將結果以TSV格式輸出保存，經(jīng)Cytoscape3.8.0軟件進行分析，得到靶蛋白PPI網(wǎng)絡圖，該網(wǎng)絡圖包含節(jié)點131個，邊868條。根據(jù)String數(shù)據(jù)庫中度值（Degree）的大小，采用Cytoscape軟件對節(jié)點及邊的大小與顏色進行設置，度值越大，節(jié)點越大，顏色越深，表示該點在PPI網(wǎng)絡中起著關鍵作用；邊越粗，表示蛋白質之間的相互作用越大，見圖2。選取大于度值平均值（13.0）的靶點作為荔枝核的關鍵靶點，共54個。由圖2可見，腫瘤抑制蛋白（Cellular tumor antigen p53,TP53）、轉錄因子AP-1（Transcription factor AP-1,JUN）、血管內(nèi)皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、表皮生長因子（Pro-epidermal growth factor,EGF）、c-Fos人原癌基因（Proto-oncogene c-Fos,FOS）和白細胞介素-8（Interleukin-8,CXCL8）等靶點在該PPI網(wǎng)絡中位于核心位置，提示在抗炎作用中起關鍵調(diào)控作用。

圖2 荔枝核靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡Fig.2 The protein interaction network of seed target

2.4 構建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡并分析

2.4.1 構建“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡 將荔枝核的活性成分Mandenol（1）、Ethyl oleate(NF)（2）、beta-sitosterol（3）、sitosterol（4）、Stigmasterol（5）、ent-Epicatechin（6）及quercetin（7）與相對應的炎癥靶點蛋白（即共7個活性成分、162個潛在的靶點蛋白）導入Cytoscape3.8.0軟件，構建活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡圖，如圖3所示，紅色代表荔枝核篩選的活性成分，綠色代表活性成分所作用的靶點，該網(wǎng)絡圖含有節(jié)點186個，邊228條，體現(xiàn)了荔枝核多成分、多靶點的作用。

圖3 活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡Fig.3 The network of active components-potential targets

2.4.2 構建“活性成分-關鍵靶點-疾病”網(wǎng)絡 將2.3項下PPI網(wǎng)絡獲取的54個關鍵靶點與所對應的6個活性成分（因化合物ent-Epicatechin與關鍵靶點無相互作用關系，故不在圖中顯示）構建“荔枝核-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，如圖4，紫色正方形代表荔枝核、黃色菱形代表活性成分、藍色圓形代表活性成分所作用的靶點、紅色菱形代表疾病。由圖4可見，該網(wǎng)絡中含有節(jié)點62個、邊132條，其中作用靶點較多的活性成分是quercetin（47個）、beta-sitosterol（7個）和Stigmasterol（6個），提示以上3個成分是荔枝核發(fā)揮抗炎作用的關鍵活性成分。

圖4 活性成分-關鍵靶點-疾病網(wǎng)絡Fig.4 The network of active components-key targets-diseases

2.5 GO分析和KEGG通路富集分析

2.5.1 GO分析 將2.2項下獲取的162個潛在的抗炎靶點通過WebGestalt進行生物過程（biological process,BP）、細胞組分（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）分析，以P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05為條件，篩選靠前的GO富集分析，如圖5所示。圖中縱坐標表示標準化富集分數(shù)，橫坐標表示富集條目，其中GO-BP主要為應激反應（response to stimulus）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）和代謝過程（metabolic process）等；GO-CC主要為細胞膜（membrane）、細胞核（nucleus）和含蛋白質復合物（proteincontaining complex）等；GO-MF主要為蛋白質結合（protein binding）、離子結合（ion binding）和分子傳感器活性（molecular transducer activity）等。

圖5 GO富集分析Fig.5 The GO enrichment analysis

2.5.2 KEGG通路富集分析 對荔枝核潛在的162個靶點蛋白進行KEGG通路富集分析，篩選出顯著的前10條信號通路（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05），見表2。主要涉及的信號通路為膀胱癌信號通路（Bladder cancer signaling pathway）、胰腺癌信號通路（Pancreatic cancer signaling pathway）、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、非小細胞肺癌信號通路（non-small cell lung cancer signaling pathway）、前列腺癌信號通路（prostate cancer signaling pathway）、乙型肝炎病毒信號通路（HepatitisB signaling pathway）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathway）、卡波西肉瘤相關皰疹病毒（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus,KSHV signaling pathway）、人巨細胞病毒感染信號通路（Human cytomegalovirus infection signaling pathway）和癌癥信號通路（Pathways in cancer）。此外，通過KEGG通路富集分析條形圖直觀地展現(xiàn)了每條信號通路中荔枝核抗炎靶點的富集比，如圖6所示，縱坐標表示富集通路的名稱，橫坐標表示富集比。

圖6 KEGG通路富集分析Fig.6 The KEGG pathway enrichment analysis

表2 荔枝核抗炎關鍵靶點KEGG通路Table 2 The KEGG pathway of key anti-inflammatory targets of seeds

表2 荔枝核抗炎關鍵靶點KEGG通路Table 2 The KEGG pathway of key anti-inflammatory targets of seeds

通路編號Pathway ID信號通路Signaling pathway基因數(shù)量Number of genes FDR值hsa05200 Pathways in cancer 56 0 hsa05163 Human cytomegalovirus infection 30 0 hsa05167 Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection 28 0 hsa05161 Hepatitis B 30 0 hsa05418 Fluid shear stress and atherosclerosis 27 0 hsa04933 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 27 0 hsa05215 Prostate cancer 25 0 hsa05212 Pancreatic cancer 21 0 hsa05219 Bladder cancer 19 0 hsa05223 Non-small cell lung cancer 18 7.24E-15

2.6 構建“關鍵活性成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡

將荔枝核162個潛在靶點進行KEGG富集分析，對前10條信號通路所對應的靶點結合54個關鍵靶點進行比較分析，發(fā)現(xiàn)這10條信號通路中關鍵靶點占了31個，將這31個活性成分定義為核心靶點。此外，這些靶點所對應的活性成分與2.4項下預測的3個關鍵活性成分（beta-sitosterol、Stigmasterol、quercetin）一致。因此，進一步認為beta-sitosterol、Stigmasterol和quercetin這3個活性成分為荔枝核發(fā)揮抗炎作用的關鍵活性成分。

對荔枝核3個關鍵活性成分所對應的31個核心靶點和10條信號通路構建“關鍵活性成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡圖，見圖7。該網(wǎng)絡共有節(jié)點44個，邊140條。圖中紅色代表活性成分，綠色代表靶點，粉色代表通路。根據(jù)度值的大小對靶點的顏色、活性成分及信號通路節(jié)點的大小進行設置，度值越大，靶點顏色越深，表示該點在該網(wǎng)絡中起著關鍵作用；節(jié)點越大，表示該成分為主要活性成分，或該通路為主要通路。由網(wǎng)絡分析結果顯示，槲皮素（quercetin）作用于29個核心靶點，提示該成分是荔枝核發(fā)揮抗炎作用的主要活性成分。其中參與癌癥通路（Pathways in cancer）的關鍵靶點有23個，分別為JUN、TP53、VEGFA、EGF、FOS、CXCL8、半胱天冬酶9（Caspase-9,CASP9）、核受體輔激活因子（Nuclear receptor coactivator 1,NCOA1）、類視黃醇X受體（Retinoic acid receptor RXR-alpha,RXRA）、基質金屬蛋白酶2（72 kDa type IV collagenase,MMP2）、血紅素氧化酶1（Heme oxygenase 1,HMOX1）、表皮生長因 子 2（Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2,ERBB2）、過氧化物酶體增生激活受體（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、信號轉導與轉錄激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta,STAT1)、細胞周期素依賴性激酶抑制因子1A（Cyclin-dependent kinase inhibitor 1,CDKN1A）、基質金屬蛋白酶（Interstitial collagenase,MMP1)、重組人Bcl-2-樣蛋白1（Bcl-2-like protein 1,BCL2L1）、核因子E2相關因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NFE2L2）、視網(wǎng)膜母細胞瘤基因1（Retinoblastoma-associated protein,RB1）、谷胱甘肽S轉移酶P1（Glutathione S-transferase P,GSTP1）、醌氧化還原1（NAD（P）H dehydrogenase[quinone]1,NQO1）、蛋白激酶C beta II（Protein kinase C beta type,PRKCB）和胰島素樣生長因子2（Insulin-like growth factor II,IGF2）（圖6），而且大部分靶點在前5個信號通路中存在數(shù)量較高，提示荔枝核可能是通過調(diào)控該信號通路來發(fā)揮抗炎作用。此外，TP53、EGF、RB1、CDKN1A、CASP9、VEGFA和CXCL8這7個靶點在前10條信號通路里涉及到5條以上的信號通路，認為這些靶點在荔枝核治療炎癥的方面起著關鍵的作用。

圖7 關鍵活性成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡Fig.7 The key active component-core target-pathway network

3 討論

炎癥是臨床較為常見的一種病理過程，其發(fā)展一般分為3期，急性炎癥或炎癥早期主要表現(xiàn)為毛細血管擴張、通透性亢進、滲出和水腫，中期表現(xiàn)為血小板吸附及白細胞游走，晚期為肉芽組織增生[19]。中醫(yī)藥在治療炎癥疾病上具有悠久的歷史，其中荔枝核作為傳統(tǒng)的中藥材，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗炎作用，可以通過下調(diào)促炎介質轉化生長因子-1（transforming growth factor-1,TGF-1）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）和巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）等的表達，上調(diào)胞漿核因子B抑制蛋白（Inhibitor NF-B,IB）的表達，揭示荔枝核可能是通過抑制核轉錄因子-B（nuclear factor-B,NF-B）信號通路來發(fā)揮抗炎作用[20]。

本研究通過TCMSP篩選得到荔枝核8個活性成分，根據(jù)TCMSP對應的靶點，去除無靶點化合物，最終得到7個活性成分；通過PPI網(wǎng)絡獲取大于度值平均值的關鍵靶點54個；結合PPI網(wǎng)絡與KEGG信號通路分析，獲得3個關鍵活性成分，分別為槲皮素（quercetin）、-谷甾醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（Stigmasterol）。而在這54個關鍵靶點中，以上3個關鍵活性成分所對應的靶點個數(shù)分別為47、7和6個，其中槲皮素是一種黃酮類化合物，具有顯著的抗炎、抗氧化、降血壓、抗心肌缺血及缺血再灌注損傷等作用[21]，認為其主要是通過抑制炎性因子白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白細胞介素-l（Interleukin-1,IL-1）及腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-,TNF-）等的釋放，以及抑制環(huán)氧化酶（Cyclooxygenas,COX）和脂肪氧化酶（lipoxygenase,LOX）的酶活性，降低活性氧（reactive oxygen species,ROS）、一氧化氮（Nitric oxide,NO）及誘導型一氧化氮合酶（Inducible Nitric-Oxide Synthase,iNOS）的表達，從而緩解炎癥反應[22]。-谷甾醇與豆甾醇為植物甾醇類化合物，在抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等方面表現(xiàn)出明顯的生物學活性[23]，此外，研究發(fā)現(xiàn)-谷甾醇和豆甾醇均可以抑制促炎介質IL-6、IL-1、TNF-和環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）等的釋放，這可能是通過調(diào)節(jié)核轉錄因子NF-B和p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信號通路來發(fā)揮抗炎的作用[24-26]。提示荔枝核發(fā)揮抗炎作用可能與以上3個活性成分密切相關。

GO和KEGG富集分析結果顯示，荔枝核主要參與應激反應、生物調(diào)節(jié)、代謝過程、細胞膜、細胞核、含蛋白質復合物、蛋白質結合、離子結合和分子傳感器活性等分子反應；主要涉及癌癥信號通路（Pathways in cancer signaling pathway）、人巨細胞病毒感染信號通路、乙型肝炎病毒信號通路、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路和糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路等多條信號通路。參與癌癥信號通路的關鍵靶點有23個，其中的7個靶點TP53、EGF、RB1、CDKN1A、CASP9、VEGFA和CXCL8在前10條信號通路里涉及到5條以上的信號通路，提示荔枝核可能直接或間接作用于這些關鍵靶點而發(fā)揮抗炎的作用。

TP53作為一種重要的抗癌基因，其在機體內(nèi)可以通過調(diào)控細胞的生理過程以及保持多種基因的穩(wěn)定來達到抗腫瘤作用，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥病變中，50%以上的患者出現(xiàn)了該基因的突變[27]。此外，在炎癥發(fā)生的后期，同樣可見TP53基因發(fā)生突變，蛋白半衰期延長，使得TP53蛋白的表達水平顯著升高[28]。EGF是發(fā)現(xiàn)于1962年的表皮細胞生長因子，是由53個氨基酸殘基組成的活性多肽，EGF家族主要包括轉化生長因子-（transforming growth factor-,TGF-）、表皮生長素（epiregulin,EREG）、肝素結合表皮生長因子（hepari n-binding EGF,HB-EGF）、雙調(diào)蛋白（amphiregulin）、細胞素（ cellulin）和表皮細胞分裂原（epigen）[29]，而EGFR是表皮生長因子受體，研究顯示，當胃黏膜受到損害因子破壞時，EGF與EGFR可以進行特異性結合，進一步促進胃黏膜上皮細胞的再生和修復，從而緩解炎癥反應，到達治療胃潰瘍的作用[30]。可見TP53和EGF基因與炎癥反應密切相關。本研究顯示，TP53、EGF、RB1、CDKN1A、CASP9、VEGFA和CXCL8等基因在荔枝核PPI網(wǎng)絡圖中的度值均較高，表明這些基因之間的相互作用關系較大，因此，我們推測荔枝核發(fā)揮抗炎作用的活性成分可能是槲皮素、-谷甾醇和豆甾醇；推斷荔枝核抗炎的主要作用靶點是TP53、EGF、RB1、CDKN1A、CASP9、VEGFA和CXCL8基因。

綜上所述，荔枝核為傳統(tǒng)抗炎中藥，具有多成分、多靶點和多通路的特點。本研究通過網(wǎng)絡藥理學初步探討了荔枝核抗炎的主要活性成分與靶點的相互作用關系，結果顯示，荔枝核抗炎有效成分可能是槲皮素、-谷甾醇和豆甾醇等，主要作用靶點為TP53、EGF、RB1、CDKN1A、CASP9、VEGFA和CXCL8等，主要調(diào)控細胞的應激反應、生物調(diào)節(jié)和代謝過程等生物過程，作用于癌癥、人巨細胞病毒感染、乙型肝炎病毒和AGE-RAGE等信號通路上，最終達到抗炎的作用。鑒于網(wǎng)絡藥理學的局限性，因此研究結果有待進一步通過基礎實驗研究加以驗證。