大柴胡湯及其“方劑要素”對(duì)NAFLD模型大鼠“腸-肝軸”作用的相關(guān)分析

王敏 周璐 孫燕 陳琳 吳夢(mèng)瑤 張鑫蕾 張淑靜 高譽(yù)珊 楊佳敏 鄭豐杰 李宇航

摘要 目的：對(duì)大柴胡湯及其“方劑要素”對(duì)NAFLD模型大鼠“腸-肝軸”作用機(jī)制進(jìn)行相關(guān)分析，揭示大柴胡湯的配伍規(guī)律。方法：105只大鼠分為正常組、模型組、鹽酸吡格列酮組、疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄?jié)峤M、大柴胡湯組，按照方法造模及給藥，檢測“肝軸”及“腸軸”相關(guān)指標(biāo)，采用Critic法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果：與正常組比較，模型組“肝軸”以及“腸軸”各個(gè)指標(biāo)權(quán)重之和Z總1、Z總2差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，鹽酸吡格列酮組、疏肝利膽組、通腑泄?jié)峤M以及大柴胡湯組“肝軸”各個(gè)指標(biāo)權(quán)重之和Z總1差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），鹽酸吡格列酮組、健脾化痰組、通腑泄?jié)峤M以及大柴胡湯組“腸軸”各個(gè)指標(biāo)權(quán)重之和Z總2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。腸道菌群分析顯示，通腑泄?jié)岱絼┮貙?duì)改善NAFLD模型大鼠腸道菌群優(yōu)勢(shì)顯著，能提高NAFLD大鼠腸道菌群中擬桿菌屬、薩特氏菌屬、假丁酸弧菌屬細(xì)菌和Akkermansia muciniphila等有益菌的相對(duì)豐度。結(jié)論：大柴胡湯中疏肝利膽方劑要素主要通過疏利肝膽作用顯著調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝以及肝臟免疫功能，即調(diào)節(jié)“肝軸”;大柴胡湯中健脾化痰方劑要素主要通過健運(yùn)脾胃、化痰作用改善腸黏膜屏障功能，即調(diào)節(jié)“腸軸”;大柴胡湯中通腑泄?jié)岱絼┮刂饕{(diào)節(jié)腸道菌群;大柴胡湯全方則可同時(shí)作用于“肝軸”和“腸軸”，對(duì)NAFLD模型大鼠起治療作用。

關(guān)鍵詞 非酒精性脂肪性肝病;大柴胡湯;方劑要素;疏肝利膽;健脾化痰;通腑泄?jié)?腸-肝軸;CRITIC法;綜合評(píng)價(jià)

Relevant Analysis of Dachaihu Decoction and its “Formula Elements” on the “Intesine-liver axis” in the NAFLD Model

WANG Min，ZHOU Lu，SUN Yan，CHEN Lin，WU Mengyao，ZHANG Xinlei，ZHANG Shujing，GAO Yushan，YANG Jiamin，ZHENG Fengjie，LI Yuhang

（School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To observe the effects of Dachaihu Decoction and various “formula-factors” on action mechanism of “Intestine-liver axis” of NAFLD model and to reveal the compatibility rule of Dachaihu Decoction.Methods：A total of 105 rats were divided into a normal group，a model group，a Western medicine group，a Shugan Lidan Decoction group，a Jianpi Huatan group，a Tongfu Xiezhuo group and a Dachaihu decoction group.According to the method of modeling and administration，the relevant indexes of“l(fā)iver axis”and“gut axis”were detected，and the comprehensive evaluation was carried out by the Critic method.Results：Compared with the normal group，in the model group，Z總1 、Z總2 of the sum of the weights of each index of“l(fā)iver axis”and“gut axis”is statistically significant（P<0.05）.Compared with the model group，there were significant differences in the sum weight of Z總1 in liver axis in the Pioglitazone hydrochloride group，dispersing stagnated liver qi for promoting bile flow group，catharis and dispel turbidity group and the Dachaihu Decoction group.And there were significant differences in the sum weight of Z總2 in the Pioglitazone hydrochloride group，dispersing stagnated liver qi for promoting bile flow group，Catharis and dispel turbidity group and the Dachaihu Decoction group.The analysis of intestinal flora showed that Tongfu Xiezhuo Formula have significant advantages in improving intestinal flora of NAFLD model rats.It can increase the relative abundance of beneficial bacteria in intestinal flora of NAFLD rats，such as Bacteroides，Sartoria，Vibrio pseudobutyricum and Akkermansia muciniphila.Conclusion：Formula factors of“Shugan Lidan formula”mainly regulate lipid metabolism of liver and liver immune function，namely，regulating“l(fā)iver axis”.The Jianpi Huatan Formula factors of the prescription mainly improves intestinal mucosal barrier function-that is，regulating the“intestinal axis”.The Tongfu Xiezhuo formula factors of the Dachaihu Decoction can regulate intestinal flora; Dachaihu Decoction can act on both“l(fā)iver axis”and“intestinal axis”at the same time，and has therapeutic effects on NAFLD model rats.

Keywords Nonalcoholic fatty liver disease; Dachaihu Decoction; Formula factors; Dispersing stagnated liver qi for promoting bile flow; Invigorate the spleen and dissapte phlegm; Catharis and dispel turbidity; Intestinal-liver shaft; CRITIC method; Comprehensive evaluation

中圖分類號(hào)：R242文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.012

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，其病理學(xué)改變與酒精性肝?。ˋLD）相似，但患者無過量飲酒史，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD的患病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，全球NAFLD患病率約為25.24%。其中北美洲24.1%、歐洲23.7%、亞洲27.4%、中東31.8%、非洲13.5%、南美洲30.5%[2]。雖然NAFLD由單純脂肪肝發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化的時(shí)限很長，但由于其代謝紊亂、血脂升高，與心腦血管疾病的發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，現(xiàn)在也越來越引起人們的重視，成為21世紀(jì)我國乃至全球重要的公共健康問題之一。

NAFLD在單純脂肪肝或肝炎早期多無明顯癥狀，現(xiàn)代臨床多采用調(diào)節(jié)生活節(jié)奏，調(diào)整飲食習(xí)慣以及加強(qiáng)鍛煉等方式加以干預(yù)，中醫(yī)藥在其治療上有明顯優(yōu)勢(shì)。大柴胡湯是《傷寒論》經(jīng)典方劑，具有和解少陽、內(nèi)瀉熱結(jié)之功效，符合臨床上大多數(shù)NAFLD患者肝膽氣機(jī)不利，脾虛痰濕中阻，陽明濁氣不降的證候特點(diǎn)，而廣泛應(yīng)用于臨床治療NAFLD，療效確切。

現(xiàn)代臨床上應(yīng)用大柴胡湯治療NAFLD的效應(yīng)研究較多，但其作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)的基礎(chǔ)研究甚少，藥理機(jī)制不能用線性邏輯關(guān)系去推理，影響了該方臨床治療NAFLD療效的進(jìn)一步提高及化裁應(yīng)用。證候要素、方劑要素的提出以及對(duì)中醫(yī)復(fù)方靶點(diǎn)認(rèn)識(shí)的不斷加深為我們提供了一個(gè)研究思路[3]，“方-證要素對(duì)應(yīng)”不僅用來研究中醫(yī)方劑的組方原理[4-9]，也越來越多被用來研究中藥方治療疾病的現(xiàn)代作用機(jī)制[10]?；凇胺?證要素對(duì)應(yīng)”的關(guān)系，我們從大柴胡湯方劑要素的角度出發(fā)，以腸-肝軸為切入點(diǎn)，研究大柴胡湯及其拆方—即各個(gè)”方劑要素”對(duì)NAFLD模型大鼠腸-肝軸上多靶點(diǎn)的作用，從而為中藥復(fù)方治療疾病的多靶點(diǎn)作用機(jī)制研究提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠，雄性，56只，體質(zhì)量（180±20）g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。大鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)，室溫為22 ℃，濕度為50%。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d以后開始造模，整個(gè)過程中自由進(jìn)食、飲水。

1.1.2 藥物

鹽酸吡格列酮片（杭州中美華東制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：170102）。疏肝利膽藥物組成：柴胡15 g、黃芩9 g、白芍9 g;健脾化痰藥物組成：法半夏9 g、生姜15 g、大棗12 g;通腑泄?jié)崴幬锝M成：生大黃6 g、燙枳實(shí)9 g;大柴胡湯藥物組成：柴胡15 g、黃芩9 g、白芍9 g、法半夏9 g、生姜15 g、大棗12 g、生大黃6 g、燙枳實(shí)9 g。以上中藥飲片均購自北京同仁堂藥房。

1.1.3 試劑與儀器

大鼠TNF-α Elisa試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào)：ERC102a.96）;大鼠TGF-β1Elisa試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào)：ERC107B.96）;大鼠TLR4 Elisa試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，貨號(hào)：SEB824Ra）;大鼠NF-кB Elisa試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，貨號(hào)：SEA753Ra）;BCA法蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號(hào)：P1511）;Occludin抗體（英國abcam公司，貨號(hào)：ab167161）;ZO-1抗體（美國proteintech公司，貨號(hào)：21773-1-AP-50）;引物[英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司，訂單號(hào)：4378367];大鼠sIgA試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào)：ERC015）。

全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司，美國，型號(hào)：au5800）;小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)[德國艾本德股份公司（Eppendorf AG），德國，型號(hào)：5417R];臺(tái)式恒溫振蕩器（太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，型號(hào)：THZ-D）;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)：JY96-IIN）;電泳儀（美國BIO-RAD公司，美國，型號(hào)：Mini-PROTEAN）;脫色搖床（太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，型號(hào)：TS-1）;生物分子成像儀（美國BIO-RAD公司，美國，型號(hào)：LAS-4000MINI）;紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）有限公司，型號(hào)：UV-2600型）;MyCyclerPCR儀（美國BIO-RAD公司，美國，型號(hào)：T100）;熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司，美國，型號(hào)：stepone-plus）;全波長酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技公司，美國，型號(hào)：MultiskanMK3）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

105只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、鹽酸吡格列酮組、疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄?jié)峤M、大柴胡湯組，其中每組7只用于電鏡取材，其余8只大鼠血清、肝、腸組織用于指標(biāo)檢測。

參照文獻(xiàn)[11]選高脂高糖飼料配方，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后選定高脂高糖飼料配方為：52.5%維持飼料+30%蔗糖+10%豬油+2%膽固醇+5%蛋黃粉+0.5%膽酸鈉。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d以后，除正常組大鼠外均給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)16周建立NAFLD模型，正常組給予維持飼料喂養(yǎng)。所有組大鼠均自由飲食、飲水。

1.2.2 給藥方法

實(shí)驗(yàn)用陽性對(duì)照藥選取鹽酸吡格列酮片，所用藥物購自京東大藥房（中美華東制藥，批號(hào)：170102）。藥物劑量參照文獻(xiàn)[12]為10 mg/（kg·d），按大鼠體質(zhì)量折算，將片劑研為粉末，溶于蒸餾水做成懸濁劑放入4 ℃冰箱備用。

實(shí)驗(yàn)用方大柴胡湯為《傷寒論》經(jīng)典原方，所用中藥全部購自于北京同仁堂藥房，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論與關(guān)鍵技術(shù)研究中心鑒定為正品。生藥劑量比例參《方劑學(xué)》[13]大柴胡湯全方（柴胡15 g、黃芩9 g、白芍9 g、法半夏9 g、生姜15 g、大棗12 g、生大黃6 g、燙枳實(shí)9 g），按照體表面積法[14]換算求得大鼠單位體質(zhì)量生藥量8.64 g/kg。疏肝利膽藥物組成為柴胡15 g、黃芩9 g、白芍9 g，由體表面積法算得大鼠單位體質(zhì)量生藥量為3.39 g/kg;健脾化痰藥物組成為法半夏9 g、生姜15 g、大棗12 g，由體表面積法算得大鼠單位體質(zhì)量生藥量，并擴(kuò)大10倍后為3.70 g/kg;通腑泄?jié)崴幬锝M成為生大黃6 g、燙枳實(shí)9 g，由體表面積法算得大鼠單位體質(zhì)量生藥量為1.54 g/kg。用蒸餾水將藥物浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮30 min，倒出，加蒸餾水再煎取一遍，將兩次所得煎液合并，用雙層紗布過濾，水浴蒸發(fā)濃縮，分別標(biāo)記后貯存于冰箱備用。

第13～16周，分別給鹽酸吡格列酮組、疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄?jié)峤M、大柴胡湯組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，3 mL/只，1次/d，正常組及模型組于相同時(shí)間給予同等劑量蒸餾水灌胃。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

實(shí)驗(yàn)第16周，末次灌胃給藥后12 h（禁食水12 h），稱量大鼠體質(zhì)量，詳細(xì)記錄一般情況，后采用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉各組大鼠，仰位固定，開胸，腹主動(dòng)脈取血，采集肝臟、回腸組織凍存?zhèn)溆?。同時(shí)，剖開大腸，取糞便分裝于事前高壓滅菌過的無菌凍存管，液氮凍存后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱待送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行檢測。整個(gè)操作過程嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，避免樣本污染，避免反復(fù)凍融。

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均遵守美國國立衛(wèi)生院倡導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷、使用指導(dǎo)原則，及以減少、替代和優(yōu)化為核心的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則。本研究通過了北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)：BUCM-1-2017051030-2030）。

血清三酰甘油（Triacylglycerol，TG）、總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（High-density Lipoprotein，HDL），低密度脂蛋白（Low-density Lipoprotein，LDL）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）由全自動(dòng)生化儀（北京中醫(yī)藥大學(xué)科研中心）測定。Elisa法測定大鼠肝組織中TNF-α、TLR4、NF-кB、TGF-β以及腸組織sIgA含量。Western Blot法測定大鼠腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)。RT-qPCR法測定大鼠腸組織Occludin mRNA、ZO-1 mRNA表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.3.1 無量綱化處理

在運(yùn)用Critic法對(duì)腸-肝軸指標(biāo)進(jìn)行分析時(shí)，由于指標(biāo)間的單位不同，需進(jìn)行無量綱化處理，消除單位不同的影響。同時(shí)，由于指標(biāo)中存在高優(yōu)指標(biāo)（指標(biāo)值越高則結(jié)果越優(yōu)：HDL-C，sIgA，Occludin mRNA，ZO-1 mRNA，Occludin蛋白，ZO-1蛋白）與低優(yōu)指標(biāo)（指標(biāo)值越低則結(jié)果越優(yōu)：ALT，AST，TC，TG，LDL-C，NF-кB，TGF-b1，TLR4，TNF-α），因此需分別進(jìn)行無量綱化處理，公式如下：

高優(yōu)指標(biāo)無量綱化處理：Zij=xijmax（xij）

低優(yōu)指標(biāo)無量綱化處理：Zij=max（xij）xij

1.3.2 計(jì)算指標(biāo)間的相關(guān)性與沖突系數(shù)

利用pearson相關(guān)系數(shù)，對(duì)無量綱化后的指標(biāo)計(jì)算指標(biāo)間的相關(guān)性，公式如下：

rij=Cov（Zi，Zj）D（Zi）D（Zj）

沖突性系數(shù)與指標(biāo)的相關(guān)性相反，相關(guān)性越高則沖突性越低，其公式如下：

Rj=i=1（1-rij）

以上公式中Cov（Zi，Zj）為Zi，Zj的協(xié)方差，D（Zi）、D（Zj）分別為Zi、Zj的方差。rij代表第i個(gè)指標(biāo)與第j個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性。Rj表示第j個(gè)指標(biāo)的沖突性。

1.3.3 計(jì)算客觀權(quán)重

指標(biāo)的客觀權(quán)重通過如下公式進(jìn)行求解：

Cj=σjRj

wj=Cjj=1Cj

公式中σj代表第j個(gè)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差即沖突性。Cj為指標(biāo)j的信息量。

2 結(jié)果

2.1 各指標(biāo)的變異性、沖突性、信息量、客觀權(quán)重值見表1。

2.2 肝軸指標(biāo)、腸軸指標(biāo)綜合評(píng)價(jià) 見表2。

2.3 各組腸道菌群中起重要作用的微生物 見表3。

3 討論

NAFLD是指除外一些明確損肝因素所導(dǎo)致的主要以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為特征的臨床病理綜合征，屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”“痞滿”“肝脹”“肝痞”“肝癖”“肝著”“積聚”“痰證”“痰濁”“濕阻”“瘀證”“肥氣”“積證”等疾病范疇。NAFLD的發(fā)病機(jī)制并不十分明確，對(duì)其的研究大多處于假說階段，“二次打擊”學(xué)說占據(jù)主導(dǎo)地位，隨著1998年Marshall正式提出“腸-肝軸”概念，腸道因素在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用越來越引起人們的重視。

腸-肝軸的“肝軸”主要包括脂質(zhì)代謝以及氧化應(yīng)激反應(yīng)。肝臟為脂質(zhì)代謝中心，脂質(zhì)代謝過程中任何一個(gè)小環(huán)節(jié)異常均會(huì)改變正常情況下的動(dòng)態(tài)平衡[15]，從而導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂肪堆積等一系列變化[16]。TC、TG、HDL、LDL反應(yīng)脂質(zhì)代謝情況，而ALT、AST反映肝細(xì)胞炎性反應(yīng)、受損以及肝臟損害程度的指標(biāo)。胰島素抵抗、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是NAFLD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，TNF-α通過降低胰島素受體-酪氨酸激酶的活性[17]、介導(dǎo)肝臟損傷的重要炎性反應(yīng)因子[18]、減弱線粒體的呼吸功能[19]等參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。NF-кB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，在肝細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)-線粒體損傷中發(fā)揮重要作用，NF-кB活化后作用于TNF-α，產(chǎn)生大量炎性遞質(zhì)，激活bax等線粒體上的促凋亡蛋白，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡，參與NAFLD發(fā)展進(jìn)程[20]，TNFα/NF-κB信號(hào)通路在各種信號(hào)刺激的條件下促進(jìn)了NAFLD的發(fā)展[21]。TGF-β1通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和激活肝星狀細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成，孫丹莉等人研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1隨脂肪肝程度加重而升高，并且與肝活檢所見肝組織炎性反應(yīng)改變密切相關(guān)[22]。TLR4信號(hào)途徑的激活，還可通過促進(jìn)促炎性反應(yīng)細(xì)胞因子的合成與釋放，增強(qiáng)胰島素受體底物（IRS）中絲氨酸發(fā)生磷酸化，進(jìn)一步調(diào)控下游酪氨酸激酶的活性下調(diào)，并且能夠阻斷下游胰島素信號(hào)的遞增傳遞。同時(shí)，TLR4信號(hào)途徑的激活，還可以通過抑制胰島素受體有效結(jié)合IRS-1，進(jìn)一步誘發(fā)機(jī)體內(nèi)部葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（Glucose-transporter，GLUT）4的表達(dá)水平降低，最終誘發(fā)肝臟胰島素抵抗的發(fā)生[23]。TLR4作為Toll樣受體家族中的重要環(huán)節(jié)，在各種肝臟細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其介導(dǎo)的信號(hào)通路參與胰島素抵抗，引起氧化應(yīng)激，誘發(fā)炎性反應(yīng)[24]?？偠灾?，TNF-α、NF-кB、TGF-β1和TLR4在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，TC、TG、HDL、LDL、TNF-α、NF-кB、TGF-β1和TLR4是反應(yīng)NAFLD發(fā)生發(fā)展在腸-肝軸中“肝軸”的體現(xiàn)。

腸道黏膜不僅承擔(dān)著消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的功能，同時(shí)也是機(jī)體最大的儲(chǔ)存細(xì)菌器官和阻擋毒素、病原微生物侵入的主要門戶[25]，腸道黏膜屏障包括生物屏障、機(jī)械屏障、免疫屏障和化學(xué)屏障，腸道黏膜屏障功能在NAFLD發(fā)病中占有重要作用[26]。腸黏膜通透性主要與機(jī)械屏障相關(guān)，腸黏膜機(jī)械屏障主要由腸頂端膜腸上皮細(xì)胞（Intestinal Epithelial Cells，IECs）和上皮緊密連接蛋白（Tight Junction Protein，TJP）與菌膜三者組成，緊密連接作為腸黏膜機(jī)械屏障最重要的連接方式，由Occludin蛋白、Claudin蛋白、ZOs等結(jié)構(gòu)蛋白及各類連接蛋白分子共同組成[27]?！澳c-肝軸”與NAFLD發(fā)生密切相關(guān)，NAFLD發(fā)生時(shí)腸黏膜機(jī)械屏障破壞，通透性增加。Xin D[28]通過對(duì)28名轉(zhuǎn)氨酶升高的NAFLD患者、30名轉(zhuǎn)氨酶正常的NAFLD患者以及34名健康志愿者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在NAFLD患者中，ZO-1和Occludin表達(dá)水平與轉(zhuǎn)氨酶水平呈負(fù)相關(guān)，說明了腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)與NAFLD發(fā)生密切相關(guān)。腸黏膜的屏障作用還包括免疫屏障，在腸黏膜免疫屏障中起主導(dǎo)作用的是以sIgA為主的體液免疫，防御病原菌在腸黏膜黏附和定植[29]。最主要的體液免疫防御因子sIgA，通過包裹、封閉外來的病菌與IEC的特異結(jié)合位點(diǎn)，能夠讓其喪失黏附IEC的能力。此外，sIgA不僅能夠阻止腸黏膜上皮細(xì)胞識(shí)別及攝取細(xì)菌、毒素和其他有害分子，依靠腸道機(jī)械蠕動(dòng)對(duì)病原體和毒素的清除，而且能夠減弱外部抗原刺激所引起的免疫耐受的形成，阻止腸道共棲的有益菌群對(duì)腸黏膜免疫屏障系統(tǒng)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答[30]。李生[31]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪性肝炎形成過程中小腸分泌液中sIgA含量顯著降低，說明腸道免疫屏障受到損害，并且其損害可能與腸道脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)相關(guān)。總言之，Occludin、ZO-1、sIgA是評(píng)價(jià)腸黏膜屏障功能的重要指標(biāo)，是反應(yīng)NAFLD發(fā)生發(fā)展在腸-肝軸中“腸軸”的體現(xiàn)。

Critic賦權(quán)法結(jié)合了無量綱化與協(xié)方差矩陣統(tǒng)一度量以借助比較評(píng)價(jià)確定客觀權(quán)重，具體到本研究，權(quán)重值的大小則表示其對(duì)疾病的貢獻(xiàn)度大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組“肝軸”以及“腸軸”各個(gè)指標(biāo)權(quán)重之和Z總1、Z總2比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明NAFLD模型大鼠出現(xiàn)了肝臟以及腸黏膜屏障的病理變化。與模型組比較，鹽酸吡格列酮組、疏肝利膽組、通腑泄?jié)峤M以及大柴胡湯組“肝軸”各個(gè)指標(biāo)權(quán)重之和Z總1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明鹽酸吡格列酮、疏肝利膽方劑要素、通腑泄?jié)岱絼┮匾约按蟛窈鷾梢燥@著調(diào)節(jié)NAFLD模型大鼠的肝臟脂質(zhì)代謝以及肝臟免疫，而健脾化痰方劑要素調(diào)節(jié)“肝軸”效應(yīng)不顯著。鹽酸吡格列酮組、健脾化痰組、通腑泄?jié)峤M以及大柴胡湯組“腸軸”各個(gè)指標(biāo)權(quán)重之和Z總2比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明鹽酸吡格列酮、健脾化痰方劑要素、通腑泄?jié)岱絼┮匾约按蟛窈鷾梢燥@著調(diào)節(jié)NAFLD模型大鼠腸黏膜屏障功能，而疏肝利膽方劑要素調(diào)節(jié)“腸軸”的效應(yīng)不顯著。

腸道菌群由大約1 014種微生物構(gòu)成，共同參與宿主的代謝和免疫，可以應(yīng)對(duì)機(jī)體受外部刺激所產(chǎn)生的各種適應(yīng)性反應(yīng)[32-35]。肝臟和胃腸道在解剖、功能上關(guān)系密切，近些年國外研究[36-37]顯示，肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體腸道微生態(tài)變化密切相關(guān)，腸道菌群失調(diào)及內(nèi)源性內(nèi)毒素血癥在NAFLD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[38-40]，通過調(diào)節(jié)腸道菌群，恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡，對(duì)延緩乃至阻止NAFLD的進(jìn)展可能有重要的作用，成為預(yù)防及治療該病的新方法[41]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通腑泄?jié)岱絼┮貙?duì)改善NAFLD模型大鼠腸道菌群優(yōu)勢(shì)顯著，其通過提高NAFLD大鼠腸道菌群中擬桿菌屬、薩特氏菌屬、假丁酸弧菌屬細(xì)菌和Akkermansia muciniphila等有益菌的相對(duì)豐度，改善NAFLD大鼠的糖脂質(zhì)代謝，減少肝臟中脂肪沉積，抑制腸道內(nèi)炎性反應(yīng)，維持腸黏膜屏障的完整性。

中醫(yī)學(xué)中，肝脾密切相關(guān)，尤其在病理方面，肝病傳脾，脾病及肝?！端貑枴び駲C(jī)真臟論》云：“肝受氣于心，傳之于脾”，《素問·寶命全形論》云：“土得木而達(dá)”?！峨y經(jīng)·七十七難》說：“所謂治未病者，見肝之病，則知肝當(dāng)傳之于脾，故先實(shí)脾氣，無令得受肝之邪”?！督饏T要略》更是說：“夫治未病者，見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾，四季脾旺不受邪，即勿補(bǔ)之;中工不曉其傳，見肝之病，不解實(shí)脾，惟治肝也”。NAFLD為中醫(yī)肝、脾同病之典范，其中醫(yī)病機(jī)為肝膽氣機(jī)不利，脾虛痰濕中阻，陽明濁氣不降，大柴胡湯通過將有疏利肝膽作用的藥物—柴胡、黃芩、白芍，有健脾化痰作用的藥物—半夏、生姜、大棗以及具有通腑泄?jié)嶙饔玫乃幬铩簏S、枳實(shí)配伍，達(dá)到肝、脾、大腸同治的作用，并且通過與NAFLD西醫(yī)學(xué)病理機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)方中各方劑要素與“腸-肝軸”病機(jī)軸上靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，體現(xiàn)了大柴胡湯配伍的科學(xué)性。

中醫(yī)復(fù)方治病具有多種配伍組合形式及“多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)，采用證候靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)（作用環(huán)節(jié)）相結(jié)合的研究模式，將是破解中醫(yī)復(fù)方配伍規(guī)律的重要途徑之一。本實(shí)驗(yàn)研究即是采用此種研究模式，證實(shí)了大柴胡湯及其各方劑要素在治療高脂高糖飼料喂養(yǎng)的NAFLD模型大鼠中，對(duì)應(yīng)“肝膽氣機(jī)不利”證候的方劑要素—疏肝利膽方劑要素主要對(duì)應(yīng)西醫(yī)學(xué)中“腸-肝軸”作用機(jī)制中的“肝軸”，而對(duì)應(yīng)“脾虛痰濕中阻”證候的方劑要素—健脾化痰方劑要素主要對(duì)應(yīng)“腸-肝軸”作用機(jī)制中的“腸軸”，對(duì)應(yīng)“陽明濁氣不降”證候的方劑要素—通腑泄?jié)岱絼┮?，主要調(diào)節(jié)腸道菌群，而同時(shí)也對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝、肝臟免疫以及腸黏膜屏障有調(diào)節(jié)作用。通過各方劑要素配合，全方大柴胡湯亦對(duì)應(yīng)西醫(yī)“腸-肝軸”中的“肝軸”和“腸軸”。本研究證實(shí)了大柴胡湯配伍方法的西醫(yī)病理機(jī)制規(guī)律，為開展中藥復(fù)方的靶點(diǎn)作用機(jī)制研究提供了思路和方法。

參考文獻(xiàn)

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）[J].中國醫(yī)學(xué)前沿雜志，2012，4（7）：4-10.

[2]展玉濤，李貝，張川.非酒精性脂肪性肝病的流行病學(xué)與自然史[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2017，33（5）：645-646.

[3]李宇航.談“證候要素”與“方劑要素”[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（2）：117-121.

[4]郭夢(mèng)瑩，張鑫蕾，孫燕.從“方-證要素對(duì)應(yīng)”探討梔子豉湯及其衍化方的演化規(guī)律[J].世界中醫(yī)藥，2019，14（6）：1590-1593，1597.

[5]張鑫蕾，王町囡，孫燕.瀉心湯類方及其衍化方演化規(guī)律中的“方-證要素對(duì)應(yīng)”思想探究[J].世界中醫(yī)藥，2018，13（3）：754-758.

[6]王敏，李宇航.基于“方-證要素對(duì)應(yīng)”的甘麥大棗湯治療臟躁機(jī)制分析[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（5）：366-370.

[7]王町囡，鄭豐杰，孫燕.苓桂劑“方-證要素對(duì)應(yīng)”解析[J].世界中醫(yī)藥，2017，12（3）：689-693.

[8]鄭豐杰.從方證相應(yīng)與方-證要素對(duì)應(yīng)談經(jīng)方臨床應(yīng)用[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，38（10）：653-657.

[9]劉艷紅，李宇航.從“方-證要素對(duì)應(yīng)”角度探討三承氣湯及其衍化方演化規(guī)律[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，17（4）：154-157.

[10]張川鋒，王振興，楊昆，等.依據(jù)“方-證要素對(duì)應(yīng)”分析補(bǔ)陽還五湯治療肺纖維化疾病機(jī)制[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2018，29（6）：1406-1408.

[11]李瑩，岳維蕓，沈天白.益氣清化方對(duì)非酒精性脂肪性肝病模型大鼠腸道菌群的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志，2015，49（8）：79-83.

[12]黃志磊，黃曉君，黃小利，等.雙醋瑞因?qū)?型糖尿病大鼠炎性因子和脂代謝的影響及脂肪組織chemerin的表達(dá)變化[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2017，38（5）：693-698.

[13]鄧中甲.方劑學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：78.

[14]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1090，375.

[15]Marchesini G，Bugianesi E，F(xiàn)orlani C，et al.Nonalcoholic fatty liver，steatohepatitis and the metabolic syndrome[J].Hepatology，2003，38（2）：536.

[16]Poniachik J，Mantilla C，Contreras J，et al.Obesity：risk factor for steatohepatitis and hepatic fibrosis[J].Rev Med Chil，2002，130（7）：731-736.

[17]張進(jìn)軍，陳曉雯，李居一，等.復(fù)方健胰膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝病患者血清超敏C-反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子-α和白介素-18的影響[J].安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（1）：24-27.

[18]魏永杰.細(xì)胞因子在非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用[J].國際消化病雜志，2006，26（1）：14-16.

[19]程勇，趙亞敏，蘇劍，等.非酒精性脂肪性肝病患者血清白介素-18、白介素-8、腫瘤壞死因子-α水平變化的臨床意義[J].醫(yī)學(xué)研究與教育，2009，26（3）：18-20.

[20]石海燕.BBCL-2，NF-кB，血管緊張素Ⅱ-Ⅰ受體在大鼠非酒精性脂肪肝病中的作用及其機(jī)制研究[D]，瀘州：瀘州醫(yī)學(xué)院，2013.

[21]孫婷婷，李京濤，魏海梁，等.TNFα/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控非酒精性脂肪性肝病的研究現(xiàn)狀[J].臨床肝膽病雜志，2019，35（9）：2095-2098.

[22]孫丹莉，張予蜀，張振玉，等.非酒精性脂肪性肝病患者血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1與血脂和肝臟酶學(xué)變化的臨床意義[J].中華消化雜志，2006，26（5）：348-349.

[23]殷小磊.布拉氏酵母菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠非酒精性脂肪性肝炎的療效及其作用機(jī)制的研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

[24]廖媛，池曉玲，楊以琳，等.脂必泰對(duì)非酒精性脂肪肝病大鼠肝組織ERK和TLR4表達(dá)的影響[J].中藥藥理與臨床，2019，35（6）：130-134.

[25]黎介壽.腸衰竭概念：營養(yǎng)支持與腸黏膜屏障維護(hù)[J].腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2004，11（2）：65-67.

[26]張媛媛，李晶，遲毓婧，等.腸道黏膜屏障在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用[J].臨床肝膽病雜志，2016，32（12）：2391-2394.

[27]葉艷偉，莊麗維，薄挽瀾.非酒精性脂肪性肝病患者腸黏膜肌球蛋白輕鏈激酶與緊密連接蛋白Occludin的變化[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，53（4）：342-346.

[28]Xin D，Zong-Shun L，Bang-Mao W，et al.Expression of intestinal tight junction proteins in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J].Hepatogastroenterology，2014，61（129）：136-140.

[29]ITO H，TAKEMURA N，SONOYAMA K，et al.Degree of polymerization of inulin-type fructans differentially affects number of lactic acid bacteria，intestinal immune functions，and immunoglobulin a secretion in the rat cecum[J].Journal of Agricultural and Food Chenmistry，2011，59（10）：5771-5778.

[30]BRANDT E R，HAYMAN W A，CURRIE B，et al.Functional analysis of IgA antibodies specific for a conserved epitope within the M protein of group A streptococci from Australian aboriginal endemic communities[J].International Immunology，1999，11（4）：569-576.

[31]李生，楊勇，丁百靜，等.非酒精性脂肪性肝炎大鼠腸道分泌液sIgA的變化[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2011，20（2）：124-127.

[32]Fukuda S，Ohno H.Gut microbiome and metabolic diseases[J].Semin Immunopathol，2014，36（1）：103-114.

[33]Ramakrishna BS.Role of the gut microbiota in human nutrition and metabolism[J].Journal of Gastroenterology and Hepatology，2013，28（S4）：9-17.

[34]Goel A，Gupta M，Aggarwal R.Gut microbiota and liver disease[J].J Gastroen Hepatol，2014，29（6）：1139-1148.

[35]Geurts L，Neyrinck AM，Delzenne NM，et al.Gut microbiota controls adipose tissue expansion，gut barrier and glucose metabolism：novel insights into molecular targets and interventions using prebiotics[J].Benef Microbes，2014，5（1）：3-17.

[36]Schnabl B，Brenner DA.Interactions between the intestinal microbiome and liver disease[J].Gastroenterology，2014，146（6）：1513-1524.

[37]Biedermann L，Rogler G.The intestinal microbiota：its role in health and disease[J].Eur J Pediatr，2015，174（2）：151-167.

[38]Tremaroli V，Bckhed F.Functiona interactions between the gut microbiota and host metabolism[J].Nature，2012，489（7415）：242-249.

[39]Mouzaki M，Comelli EM，Arendt BM，et al.Intestinal microbiota in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J].Hepatology，2013，58（1）：120-127.

[40]楊林輝，蔡俊，陳東風(fēng).非酒精性脂肪性肝炎患者腸道菌群的變化及意義[J].臨床肝膽病雜志，2012，28（2）：124-126.

[41]劉嘉琪，周少明.非酒精性脂肪性肝病腸道菌群的研究進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志，2017，33（12）：2453-2456.

（2019-07-09收稿 責(zé)任編輯：徐穎）