不同地理類型青楊派古樹扦插苗對干旱脅迫的響應(yīng)*

潘立，陸燕元

(1.西南林業(yè)大學(xué) 會計學(xué)院，云南 昆明 650224；2.國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實驗室,西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224)

川西高原位于青藏高原東南部，地形地貌復(fù)雜，氣候環(huán)境多樣，冰川活動，地理條件獨(dú)特，是青楊派楊樹適宜的生長地，也是我國及全球的楊樹(Populus)分布中心之一[1]，蘊(yùn)藏著豐富的古楊樹資源[2]。這些珍稀古樹是在多個生態(tài)環(huán)境因子和人為因子的長期綜合作用下生存下來的，適應(yīng)所處地區(qū)的氣候、土壤等環(huán)境條件，抗逆能力較強(qiáng)，是最地道的鄉(xiāng)土樹種。對它們進(jìn)行深入研究和利用，有利于廣大高原地區(qū)的造林綠化，在防止耕地和草地退化，提供牧畜飼料，涵養(yǎng)水源，改善生態(tài)環(huán)境和發(fā)展少數(shù)民族地區(qū)經(jīng)濟(jì)等方面都具有十分重要的意義，同時，也可為楊樹育種提供新的種質(zhì)資源。

干旱是世界上危害最為嚴(yán)重的自然災(zāi)害之一，其出現(xiàn)次數(shù)、持續(xù)時間、影響范圍、造成的損失等均居各種自然災(zāi)害之首[3]。近40 a來，隨著大氣中溫室氣體含量的升高，我國氣候總體出現(xiàn)變暖變干的趨勢[4-5]。這種趨勢對我國農(nóng)業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)以及整個生態(tài)環(huán)境造成了極大的不利影響[6]。西南地區(qū)屬于干旱半干旱氣候區(qū)，干濕季分明，時常遭受季節(jié)性干旱的影響，而且近年來干旱頻繁發(fā)生，持續(xù)的時間及程度均較嚴(yán)重。在生態(tài)環(huán)境十分脆弱的情況下生存下來的古楊樹歷經(jīng)百年乃至千年的自然環(huán)境考驗，對所處地區(qū)的氣候與土壤等環(huán)境條件的抗逆境能力較強(qiáng)，利用這些古樹資源來研究其應(yīng)對干旱的生理生化機(jī)制，從而為西南地區(qū)選擇抗旱性較強(qiáng)的古楊樹種提供理論依據(jù)和參考。

在本區(qū)域不同的地理環(huán)境中，不同種類的楊樹對氣候環(huán)境表現(xiàn)出明顯的差異，據(jù)此劃分出不同的地理類型[7]。三脈青楊(Populustrinervis)、鄉(xiāng)城楊(P.xiangchengensis)和康定楊(P.kangdingensis)分別是干熱河谷型、溫濕型及寒濕型等3種地理類型的典型代表，是全國乃至世界少有的分布于低緯度高海拔地區(qū)的寶貴楊樹資源，在高山造林、高原地區(qū)綠化樹種選擇中有極大的優(yōu)勢[8-9]。賈晨等在對川西高原的幾種鄉(xiāng)土楊樹樹種研究中發(fā)現(xiàn)，三脈青楊、鄉(xiāng)城楊和康定楊在年高生長、胸徑生長及材積生長過程中均有較大優(yōu)勢，造林效果顯著[10-11]。然而，其對環(huán)境適應(yīng)的內(nèi)在機(jī)理仍缺乏研究，因此，本試驗以胸徑≥1 m且樹齡在300～500 a的這3種古楊樹扦插幼苗為研究對象，研究它們在干旱脅迫下生理生化及分子差異響應(yīng)，以揭示其對干旱環(huán)境脅迫的適應(yīng)機(jī)理，為該地區(qū)生態(tài)環(huán)境建設(shè)中抗旱性較強(qiáng)樹種的篩選提供依據(jù)，促進(jìn)鄉(xiāng)土古楊樹資源的利用及開發(fā)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料與培養(yǎng)

本試驗于2016年對云南、四川、西藏等西南地區(qū)的古楊樹資源調(diào)查中選取胸徑≥1m，樹齡在300～500 a生的三脈青楊、鄉(xiāng)城楊和康定楊3種青楊派古楊樹為對象，分別剪取陽面上部枝條(直徑約2 cm，長度約150 cm)20個，帶回西南林業(yè)大學(xué)全自動智能溫室的試驗地中，剪成長30 cm的枝段，消毒、抹芽處理后進(jìn)行扦插。2018年5月剪取2 a生的健壯枝條進(jìn)行扦插，在成活后按照日常進(jìn)行水肥管理。于2019年6月，每種選擇10個健壯、無病蟲害、粗度、高度及生長勢大體一致的枝條，剪枝每段約30 cm，在含有1 000 mg/L生根粉和稀釋2 000倍多菌靈的水中泡足14 h后，扦插到裝滿勻質(zhì)紅壤珍珠巖的塑料盆中進(jìn)行培育。培育期間在溫室環(huán)境中生長，待苗木成活后計算扦插成活率，生長健壯、穩(wěn)定后開始試驗處理。

1.2 自然干旱脅迫試驗

干旱脅迫試驗在溫室中進(jìn)行。溫室條件為光照時間18 h，濕度為30%～55%，溫度為16～25 ℃。干旱脅迫采用自然干旱法：即當(dāng)植株長至60～80 cm時，試驗前一次性澆足水，之后不再澆水，直至植株干枯死亡，隔天進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，整個試驗過程持續(xù)12～14 d。

1.3 相關(guān)指標(biāo)測定方法

1.3.1 土壤含水量的測定

開始自然干旱脅迫后，以第0 d作為對照，采用TDR 200土壤水分測量儀(美國Spectrum)結(jié)合稱重的方法測定土壤中的相對含水量，每個樹種每個處理測定3盆，每盆測定3次，取平均值作為數(shù)據(jù)分析。

1.3.2 葉片相對含水量(RWC)的測定

按照高俊風(fēng)[12]的方法測定，從干旱第0 d開始剪取枝條頂端下數(shù)第3～4片生長良好的成熟葉片，迅速放入錫箔紙中，用分析天平稱出鮮重(Wf)，將樣品完全浸入蒸餾水中24 h，取出用吸水紙擦干樣品表面水分，稱出飽和重(Wt)。然后再放入烘箱，于105 ℃下放置0.5 h殺死葉片，后于80 ℃下烘干至恒重，稱出干重Wd，根據(jù)下列公式計算出葉片相對含水量：

RWC=(Wf-Wd)/(Wt-Wd)×100%

1.3.3 光合系統(tǒng)參數(shù)的測定

采用便攜式光合儀測定系統(tǒng)〔CIRAS-3光合儀(美國)PP SYSTEMS〕測定光合系統(tǒng)參數(shù)。于上午9：00—11：00進(jìn)行測定，選取從枝條頂端下數(shù)第3～4片生長良好的成熟葉，測定凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、細(xì)胞間CO2濃度(Ci)、水分利用效率(EWU)等參數(shù)。為了保證測量在近似于理想光合作用狀態(tài)下進(jìn)行，測定時將葉面溫度控制為25 ℃，光照強(qiáng)度控制為1 400 μmol/(m2·s)，相對濕度控制為50%左右，CO2濃度控制為(350 ± 5)μmol/mol。每盆測定3次，隔天進(jìn)行測定，直到葉片干枯旱死、凈光合速率為負(fù)值時停止測定。

1.3.4 抗氧化酶系統(tǒng)的測定

每隔2 d，10：30進(jìn)行一次統(tǒng)一采樣，分別剪取處理苗木第3、4、5完全展開葉的混合樣，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中，用于超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性、抗壞血酸過氧化物酶活性、丙二醛含量以及相關(guān)抗旱基因表達(dá)量的測定。

超氧化物歧化酶(SOD)用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法[13-15]測定?？箟难徇^氧化物酶(APX)測定參照Manon[16]、 沈文飚等[17]的方法，利用APX 在H2O2存在的條件下使抗壞血酸量減少的原理測定酶活性。過氧化物酶(POD)根據(jù)Chance和Maehly[18]的方法，利用過氧化物酶能促使愈創(chuàng)木酚氧化生成棕紅色4-鄰甲氨基苯酚，在470 nm 處有特征吸收峰，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與4-鄰甲氨基苯酚的量成比例關(guān)系，從而間接測定過氧化物酶的活性。

1.3.5 活性氧自由基指標(biāo)測定及膜脂過氧化物質(zhì)含量測定

膜脂過氧化物(MDA)的測定方法參照Hodges[19]、孫群[20]和趙世杰等[21]等所描述的硫代巴比妥酸法。過氧化氫(H2O2)含量測定參照Mukherjee和 Choudhuri的方法[22]。H2O2可與氯化鈦(TiCl4)反應(yīng)生成過氧化物-鈦復(fù)合物黃色沉淀，待黃色沉淀被H2SO4溶解后，溶液呈黃色，在415 nm處有最大吸收。超氧陰離子產(chǎn)生速率(O2-.)含量測定測定參照王愛國等[21]的方法。細(xì)胞膜透性用 DDS-11A 電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，用相對電導(dǎo)率(%)表示。

1.3.6 抗逆基因SOD，lea2、lea3組基因的瞬時表達(dá)量測定

采樣 每隔2 d ，10：30進(jìn)行采樣一次，分別剪取處理苗木頂端往下第3、4、5片完全展開葉的混合葉樣，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中，采用Real-time PCR法檢測cDNA樣本中SOD、lea2、lea3基因相對含量〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕。

RNA提取 SK8661 柱式植物總RNA抽提純化試劑盒；

RNA樣品的濃度和質(zhì)量監(jiān)測 電泳檢測-RNA電泳結(jié)果(1.5%瓊脂糖，1×TAE電泳緩沖液)，觀察并拍照。

反轉(zhuǎn)錄 第一鏈cDNA合成試劑盒(RevertAid Premium Reverse Transcriptase，Thermo ScientificTMEP0733)， RNA按照800 ng反轉(zhuǎn)。

引物序列(Primer Premier 5.0軟件設(shè)計) 選取在植物中比較保守的基因β-actin作為內(nèi)參基因，SOD，lea2、lea3組基因做為目的基因(表1)。

表1 引物及其序列Tab.1 Primers and their seqences

熒光定量PCR檢測 將cDNA樣品稀釋10倍作為模板上機(jī)檢測，定量PCR試劑采用SG Fast qPCR Master Mix(2X)(BBI)(B639271)，定量PCR儀用LightCycler 480 (美國Roche)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計所測數(shù)據(jù)，使用Excel 2010軟件進(jìn)行計算，Sigmaplot 10.0軟件作圖，由SPSS軟件(20.0版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然干旱脅迫對土壤含水量的影響

土壤含水量是影響植物生長發(fā)育的關(guān)鍵因素。土壤水分虧缺時，植物的許多功能都會受到限制。

由圖1可以看出，自然干旱脅迫對不同種古楊樹的土壤含水量都有明顯影響。隨著自然干旱脅迫處理時間的增加，土壤含水量總體呈下降趨勢，在干旱脅迫2～10 d，土壤含水量急劇下降，到第10 d以后土壤含水量處于一個較低水平，康定楊日均土壤含水量變化最快，降至16.4%，接下來土壤含水量變化變慢，但最后均已降至10%以下。

圖1 自然干旱脅迫對土壤含水量的影響注：*表示各自的處理組與對照組間存在顯著差異 (P<0.05)，下同。Fig.1 Effects of natural drought stress on soil water content

2.2 自然干旱脅迫對古楊樹扦插苗葉片生長的影響

土壤干旱持續(xù)時間對古楊樹幼苗形態(tài)產(chǎn)生顯著影響。

以三脈青楊為例(圖2)，停止?jié)菜跗?0～6 d)，植株總體形態(tài)變化并不明顯；處理10 d后，伴隨土壤含水量的顯著下降，土壤表面看起來已經(jīng)很干，輕微結(jié)塊，此時植株形態(tài)開始明顯變化，首先是葉片出現(xiàn)輕微下垂，隨后莖尖萎蔫，葉片完全下垂，最后葉片干枯，整個植株呈枯死狀態(tài)，此時表層土壤已完全變干，用硬物已經(jīng)插不進(jìn)去，但葉片沒有掉落；在后期的試驗發(fā)現(xiàn)，植株葉片干枯1個月后，幼苗一旦重新澆水，干枯的葉片會很快掉落，然后又長出新葉，說明古楊樹幼苗對干旱逆境有很好的適應(yīng)性，其恢復(fù)能力也很強(qiáng)。遭受干旱脅迫后，鄉(xiāng)城楊和康定楊形態(tài)上的變化趨勢與三脈青楊的一致，只是在關(guān)鍵時間節(jié)點(diǎn)上有輕微差異，如康定楊出現(xiàn)萎蔫的時間會提前1 d(圖3)，而鄉(xiāng)城楊則往后延長1 d(圖4)，存活的時間較長。

圖2 自然干旱脅迫對三脈青楊植株形態(tài)的影響Fig.2 Effects of natural drought stress on the plant morphology of P.trinervis

圖3 自然干旱脅迫對康定楊植株形態(tài)的影響Fig.3 Effects of natural drought stress on the plant morphology of P.kangdingensis

圖4 自然干旱脅迫對鄉(xiāng)城楊植株形態(tài)的影響Fig.4 Effects of natural drought stress on the plant morphology of P.xiangchengensis

2.3 自然干旱脅迫對古楊樹葉片相對含水量(RWC)的影響

葉片相對含水量的高低能夠反映植物的生長代謝情況。在干旱條件下，葉片相對含水量高的植物擁有更旺盛的生命功能，對干旱適應(yīng)能力更強(qiáng)[6]。從圖5可知，隨著自然干旱脅迫的持續(xù)，3種古楊樹的葉片含水量均呈現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢。自然干旱脅迫初期(0～6 d)，3種楊樹的葉片相對含水量的下降速度均較慢，與對照相比均無顯著差異。之后，隨干旱脅迫時間的延長，3種楊樹的葉片相對含水量均顯著下降，其中三脈青楊的降幅最為顯著，至干旱后期時其葉片RWC僅為對照的63%，而鄉(xiāng)城楊和康定楊分別為對照的77%和78%，表明隨著自然干旱脅迫時間的持續(xù)，鄉(xiāng)城楊和康定楊葉片保水能力較強(qiáng)，對干旱的適應(yīng)能力較強(qiáng)，而三脈青楊葉片保水能力較弱。

圖5 土壤自然干旱對古楊樹扦插苗葉片RWC的影響Fig.5 Effect of soil natural drought on RWC of ancient poplar cutting seedling leaves

2.4 自然干旱脅迫對古楊樹光合特性的影響

如圖6所示，干旱脅迫對古楊樹扦插苗葉片光合系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響。葉片凈光合速率Pn隨干旱脅迫時間的持續(xù)呈下降趨勢，但在干旱中前期(1～8 d)時降幅較為緩慢。在水分充足條件下，相對于鄉(xiāng)城楊和康定楊，雖然三脈青楊葉片Pn較低，但受到干旱脅迫后卻比較穩(wěn)定，降幅較為緩慢，例如干旱第9 d，與對照相比，其降幅僅為17%，而鄉(xiāng)城楊和康定楊21%分別為47%。干旱第10 d后， 3種楊樹的Pn均顯著下降，第12 d時，三脈青楊的Pn將為負(fù)值，呼吸作用大于光合作用，而康定楊和鄉(xiāng)城楊的光合作用則可以分別維持至12和15d(圖6A)。氣孔導(dǎo)度(Gs)的變化趨勢與Pn略微相似，隨干旱脅迫持續(xù)基本呈逐漸下降的趨勢，但康定楊在干旱初期(1～2 d)顯著下降后在中期略有上升，在干旱第9 d是才顯著下降，而鄉(xiāng)城楊和康定楊一直呈平緩下降的趨勢(圖6B)。胞間二氧化碳的濃度(Ci)受氣孔導(dǎo)度和體內(nèi)光合活性的綜合影響。在干旱中前期(1～11 d)，古楊樹扦插幼苗葉片Ci的變化不大，略有升降的起伏，3種楊樹之間的差異也不明顯；干旱后期(12 d)，三脈青楊和康定楊的Ci顯著上升，分別為對照的190%和149%，與對照差異顯著，而鄉(xiāng)城楊直至干旱脅迫的第15 d其Ci值升至對照的117%(圖6C)。葉片蒸騰速率(Tr)與氣孔導(dǎo)度密切相關(guān)，因為氣孔的開合程度影響植物體內(nèi)水分的進(jìn)出及氣體交換。由圖6 D可以看出，干旱脅迫后，Tr的變化趨勢與Gs基本相似，都是先降后升再降。一般來說，一定程度的干旱可以促進(jìn)植物水分利用效率(EWU)的提高。在本試驗中，干旱脅迫處理第1 d時，3種古楊樹的葉片的EWU輕微下降然后上升，鄉(xiāng)城楊和康定楊的EWU在干旱脅迫第2 d達(dá)到最高值，但與對照相比均沒達(dá)到顯著性差異，而三脈青楊受干旱脅迫后葉片EWU逐漸上升，至第5～6 d時達(dá)到最大值，隨后開始顯著下降?？傮w上來說，鄉(xiāng)城楊的EWU至干旱后期變化較為平緩，干旱脅迫第15 d時降幅為對照的63%，而三脈青楊分別為193%和134%，與對照的差異極為顯著(圖6E)。

圖6 土壤自然干旱對對古楊樹扦插苗葉片光合特性的影響Fig.6 Effects of natural drought on photosynthetic characteristics of ancient poplar cuttings

2.5 自然干旱脅迫對古楊樹抗氧化酶系統(tǒng)的影響

土壤自然干旱處理對古楊樹3個種的葉片超氧化物歧化酶SOD活性變化產(chǎn)生不同影響(圖7)。隨干旱脅迫時間的持續(xù)，三脈青楊葉片SOD呈現(xiàn)升—降—升—降的雙峰值趨勢，在干旱的第2 d和4 d分別出現(xiàn)次大和最大峰值，漲幅分別為37%和32%，與對照差異顯著，干旱后期略有上升，隨后降至對照水平。鄉(xiāng)城楊葉片SOD受到干旱脅迫后逐漸上升，第10 d時達(dá)到最大值，漲幅為181%，后期略有下降，但與對照相比，漲幅仍然較大，為147%，與對照達(dá)到極顯著差異水平(P<0.001)。受到干旱脅迫后，康定楊葉片SOD總體上變化不明顯，至干旱第14 d時升至最大值，漲幅為23%，與對照差異不明顯?？箟难徇^氧化物酶(APX)在土壤自然干旱過程中的變化趨勢與SOD不同，在3個樹種中的表現(xiàn)也不同。土壤自然干旱處理下，三脈青楊葉片APX先顯著升后降再上升，至干旱后期(第14 d)時達(dá)到最大值，漲幅為430%，與對照相比差異極為顯著。而鄉(xiāng)城楊和康定楊在干旱脅迫的影響下，APX活性均逐漸下降，鄉(xiāng)城楊在干旱第14 d時略有回升，但沒有恢復(fù)到對照水平，在整個干旱過程中鄉(xiāng)城楊和康定楊的APX活性降幅與對照相比沒有達(dá)到顯著性差異，兩個種之間差異也不顯著。過氧化物酶POD受干旱的影響與SOD相似，呈升—降—升—降的雙峰變化趨勢，但變化幅度較小。其中，康定楊POD的變化趨勢最為顯著，在干旱脅迫第4d和第10d，其值達(dá)到最高值，漲幅為110%，與對照差異顯著。三脈青楊POD酶活性最小，在干旱第10 d達(dá)到最大值是漲幅僅為對照的35%，而鄉(xiāng)城楊葉片POD活性在干旱的第8 d和10 d漲幅分別為對照的54%和47%左右，差異顯著。

圖7 土壤自然干旱對古楊樹扦插苗葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響Fig.7 Effect of soil natural drought on antioxidant enzyme system of ancient poplar cutting

2.6 自然干旱脅迫對古楊樹葉片活性氧含量的影響

丙二醛MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，含量越高表明膜脂受到的傷害越嚴(yán)重。如圖8所示，受旱后，三脈青楊和鄉(xiāng)城楊葉片MDA含量逐漸上升，到干旱后期達(dá)最大值，漲幅分別為184%和70%，前者與對照達(dá)到及顯著差異，后者差異顯著；康定楊則先升后降再升，干旱后期漲幅為277%，差異極為顯著。這些結(jié)果表明受干旱脅迫后，3個古楊樹扦插苗的膜脂均受到較大的破壞，其中康定楊受損最為嚴(yán)重，而鄉(xiāng)城楊相對較輕。細(xì)胞膜是活細(xì)胞與環(huán)境之間的界面和屏障，各種不良環(huán)境對細(xì)胞的影響往往首先作用于細(xì)胞膜，改變其透性， 而相對電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)，其值越大，表示電解質(zhì)的滲漏量越多，細(xì)胞膜受害程度越重。如圖8所示，干旱脅迫持續(xù)時間對不同種古楊樹的細(xì)胞膜相對透性產(chǎn)生很大影響。土壤自然干旱處理后的1～8 d，3個樹種葉片細(xì)胞膜相對透性均呈先上升后下降的趨勢，但變化幅度不大，3種楊樹之間也沒有明顯的差異;干旱第10 d，該值開始呈顯著上升的趨勢，干旱第14 d均達(dá)到最大值，與對照相比，三脈青楊、鄉(xiāng)城楊和康定楊分別上升了264%，224%和184%，差異極為顯著。表明在一定的干旱范圍內(nèi)，古楊樹通過自身的調(diào)節(jié)，可以減輕細(xì)胞膜受干旱的傷害，一旦超過一定的范圍，植物各個功能失調(diào)，細(xì)胞膜相對透性增大，電解質(zhì)流失嚴(yán)重。

圖8 土壤自然干旱對古楊樹扦插苗葉片細(xì)胞膜的影響Fig.8 Effect of soil natural drought on cell membrane system of ancient poplar cutting

過氧化氫(H2O2)是活性氧的一種，多種外界刺激或細(xì)胞內(nèi)信號分子都可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)H2O2的積累。如圖9所示，自然干旱處理下，三脈青楊和康定楊過氧化氫(H2O2)逐漸升高，中期略有下降，后期又上升；而鄉(xiāng)城楊在干旱前期0～6 d無明顯變化，8 d時明顯上升；三脈青楊、康定楊和鄉(xiāng)城楊在干旱第14 d時均達(dá)到最大值，上升幅度分別問其對照的 192%，201%和202%。由此可見，不同種的古楊樹葉片過氧化氫含量對干旱處理的反應(yīng)在時間和積累量上存在差異。

圖9 土壤自然干旱對古楊樹扦插苗葉片活性氧含量的影響Fig.9 Active oxygen content of natural soil drought to the ancient poplar cutting seedlings

超氧陰離子具有獨(dú)特的生理功能，當(dāng)其處于非平衡濃度時，則會引起組織損傷。由圖9可以看出，在自然干旱脅迫下，三脈青楊、康定楊和鄉(xiāng)城楊3個樹種的超氧陰離子O2-.變化趨勢基本一致，先升后降再升，干旱后期上升幅度分別為120%，170%和49%，與對照差異顯著，鄉(xiāng)城楊后期積累的O2-.最多，而康定楊最低。

2.7 自然干旱脅迫對古楊樹抗旱基因表達(dá)的影響

3種古楊樹葉片的SOD基因瞬時表達(dá)量在干旱初期(1～6 d)時均逐漸上升，三脈青楊從第8 d開始顯著下降，直至干旱后期(第14 d)康定楊才開始下降，而鄉(xiāng)城楊一直呈上升的趨勢。表明干旱脅迫激發(fā)了SOD基因的瞬時表達(dá)量，尤其在干旱的初期和中期，而鄉(xiāng)城楊在后期SOD基因順勢表達(dá)量增量更為明顯(圖10)。干旱脅迫對3種古楊樹葉片Lea2瞬時表達(dá)量影響顯著。干旱初期，3種楊樹葉片Lea2瞬時表達(dá)量隨干旱脅迫時間的持續(xù)而呈顯著上升的趨勢，三脈青楊和鄉(xiāng)城楊在干旱脅迫的第6 d升至最高值，而康定楊則在第8 d時升至最大值，隨后均顯著下降，到干旱后期基本回落至對照水平。3種古楊樹扦插苗葉片Lea3瞬時表達(dá)量受到干旱脅迫后變化趨勢與Lea2變化基本相似，均是隨干旱脅迫的加劇呈先升后降的趨勢，其中鄉(xiāng)城楊的變化幅度有所不同，即干旱后期Lea3瞬時表達(dá)量降幅較低，與對照相比差異仍比較顯著。

圖10 土壤自然干旱對古楊樹扦插苗葉片抗旱基因表達(dá)的影響Fig.10 Effect of soil natural drought on Drought resistance gene expression of ancient poplar cutting

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

隨著全球氣候變化的加劇，水分短缺問題更加突出，植物生長、產(chǎn)量受到顯著影響。到目前為止已有很多關(guān)于楊樹對干旱脅迫的形態(tài)和生理適應(yīng)的報道[25-27]。這些研究表明水分虧缺下植物可以通過改變形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長模式，調(diào)整各生理指標(biāo)如光合參數(shù)特性、抗氧化酶系統(tǒng)、抗性基因表達(dá)等來適應(yīng)干旱脅迫[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，古楊樹生長停滯、葉片相對含水量、凈光合速率、呼吸速率、蒸騰速率和胞間CO2等氣體交換指標(biāo)顯著降低，這與許多以前的研究相一致[31-32]，但不同地理類型的古楊樹在干旱脅迫下存在一系列生理和生化響應(yīng)上的差異。

自然干旱脅迫后，土壤相對含水量直線下降，干旱處理14 d時3種楊樹的土壤相對含水量均降至10%以下，其中寒濕型康定楊的日均土壤含水量降幅最顯著。植物葉片相對含水量與土壤中有效水分含量密切相關(guān)[30]。本研究中，在自然干旱脅迫前期，3種古楊樹幼苗葉片RWC變化較為平緩，而后期，三脈青楊RWC下降的幅度和速度更顯著，而鄉(xiāng)城楊則較為緩慢，表明其能更好保持體內(nèi)良好的水分狀況，對干旱的適應(yīng)能力更強(qiáng)。這可能由于三脈青楊是長期處于干熱河谷氣候區(qū)，為適應(yīng)干熱的氣候，氣孔調(diào)節(jié)更為敏感和靈活，以避免葉溫過高灼傷葉片或過度散失水分。

水分充足條件下，寒濕型康定楊光合參數(shù)均較高，而干熱河谷型的三脈青楊最低。干旱脅迫后，3種地理類型的古楊樹扦插苗葉片的光合作用均受到明顯抑制，具體表現(xiàn)為凈光合速率(Pn)顯著下降，而葉片氣孔導(dǎo)度(Gs)也同時下降，從而導(dǎo)致葉片葉綠體中CO2含量下降(由Ci值降低可以看出)。這可能是由于干旱脅迫下光合作用酶、葉綠素類及葉綠體結(jié)構(gòu)等受到影響，從而抑制了光合系統(tǒng)的作用。此外，干旱脅迫會顯著影響植物的光合電子傳遞[33-34]。干旱脅迫后，康定楊葉片中的Pn、Gs及Ci等下降幅度均顯著高于其它兩種，表明寒濕型的康定楊對干旱的適應(yīng)能力較弱；而鄉(xiāng)城楊降幅較低，且在極端干旱下(干旱處理9 d后)還能維系光合系統(tǒng)的穩(wěn)定，表明鄉(xiāng)城楊比其它兩種楊樹更適合于在極端干旱的環(huán)境下生存，因此更能解釋其分布范圍更廣的原因，這在前人的研究上也有類似的報道[33-35]。

環(huán)境脅迫能夠誘使活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生，使蛋白、膜脂發(fā)生過氧化，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的變化，從而改變細(xì)胞膜的透性[32]。作為細(xì)胞膜破環(huán)程度的指標(biāo)MDA含量和相對電導(dǎo)率的升高意味著膜脂過氧化的加劇[7]，類似的研究也在橄欖樹(OleaeuropaeaL.)中有體現(xiàn)[36]。盡管在干旱脅迫下3種古楊樹細(xì)胞膜都遭到了破壞，但康定楊葉片中MDA和EL增幅更大，表明其受到的破壞程度更高，這一方面與細(xì)胞中積累的活性氧自由基的濃度和類型直接相關(guān)，比如受旱后，三脈青楊和康定楊H2O2積累濃度較高，而鄉(xiāng)城楊積累的O2-.濃度較高，另一方面也與植物中抗氧化物酶的活性有關(guān)。研究表明，具有較高的抗氧化酶活性的植物，能夠保護(hù)其自身免受由于環(huán)境脅迫積累的ROS的傷害，控制有害脂肪酸的積累[5]。SOD主要岐化細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中的O2-.為O2和H2O2，是抵御ROS傷害的第一道防線。SOD在三脈青楊中活性最強(qiáng)，有效抑制了O2-.的積累。POD主要分布在非原質(zhì)體空間和液泡中，APX分布最廣泛，它在細(xì)胞溶質(zhì)、葉綠體、線粒體、過氧化物酶體和非原質(zhì)體空間中都被檢測到[17,30]。在干旱脅迫下，三脈青楊中除POD外，SOD，APX活性均高于其它兩種，說明三脈青楊清除ROS的能力較強(qiáng)，可有效減輕其對葉片細(xì)胞的傷害程度，類似結(jié)果在P.euphratica中也有表現(xiàn)[5,16,32]。

參與干旱脅迫相關(guān)的基因根據(jù)作用方式的不同可以分為兩類:一類是直接參與植物抗旱能力提高的功能基因，此類基因的表達(dá)產(chǎn)物能維持細(xì)胞各種理化代謝活動的正常進(jìn)行；另一類是起調(diào)節(jié)作用的蛋白基因，主要對信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)的過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，包括滲調(diào)蛋白、Lea蛋白等直接保護(hù)細(xì)胞免受水分脅迫損傷的功能蛋白基因和超氧化物酶歧化酶、抗壞血酸等毒性降解酶基因[28,34]。根據(jù)已有的研究結(jié)果[37-38]從結(jié)構(gòu)上看，Lea基因在干旱脅迫下可能與抗氧化，膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)的保護(hù)等功能有關(guān)，一是通過直接作用，還有一些是起分子保護(hù)屏障的作用。本研究中，通過熒光定量PCR分析，Lea2、Lea3組基因在干旱脅迫下在mRNA水平的瞬時表達(dá)量明顯升高，說明了這2個基因在三脈青楊耐干旱脅迫上起了顯著的作用，且兩基因在干旱脅迫下，表達(dá)量的升高和降低的時間近乎同步，表明兩基因在干旱脅迫下對植物應(yīng)急保護(hù)機(jī)制的啟動都發(fā)揮著重要的作用，這個研究結(jié)果與魯松[37]在4個青楊(P.cathayanaRehd.)種群Lea3基因表達(dá)對干旱和低溫響應(yīng)的研究結(jié)果基本一致。此外，鄉(xiāng)城楊中Lea3基因瞬時表達(dá)量增加得更顯著，表明Lea3基因在鄉(xiāng)城楊中應(yīng)對干旱逆境的作用要大于Lea2基因，但長時間脅迫時兩基因的表達(dá)量都明顯下降，說明植物依靠其他方式應(yīng)對長期干旱脅迫，如抗氧化系統(tǒng)酶活性刺激升高，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成增加等[34]。受旱后，康定楊和鄉(xiāng)城楊中葉片SOD基因瞬時表達(dá)量呈持續(xù)升高，而三脈青楊則先上升后下降，表明不同的抗旱基因在不同的地理類型中發(fā)揮的作用不同，這與青扦(Piceawilsonii)、海岸松(Pinuspinaster)、小麥(Triticumaestivum)等的試驗結(jié)果基本類似[38-41]。

3.2 結(jié)論

綜上所述，不同地理類型的古楊樹對干旱的差異響應(yīng)反映它們對當(dāng)?shù)貧夂虻倪m應(yīng)機(jī)制。受到干旱脅迫后，三脈青楊反應(yīng)迅速，抗氧化酶APX和SOD活性快速升高，抗逆基因SOD瞬時表達(dá)量也顯著增加，但干旱強(qiáng)度加劇后，三脈青楊植株受損程度最重，表明干熱河谷型三脈青楊在中輕度的干旱脅迫下適應(yīng)能力較好，但在嚴(yán)重干旱條件下適應(yīng)能力較弱。而溫濕型鄉(xiāng)城楊受旱后抗逆基因Lea3和SOD瞬時表達(dá)量均同時升高，維持相對穩(wěn)定的光合能力，表明其對干旱的適應(yīng)的綜合能力較強(qiáng)，因此可以解釋為何鄉(xiāng)城楊的分布范圍要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它兩種。在高海拔地區(qū)，一般土壤水分含量較高而且降水量充足，樹木遭受的脅迫主要是霜凍和低溫，所以長期生長在高海拔區(qū)域的寒濕型康定楊對低溫脅迫適應(yīng)能力較強(qiáng)，而對干旱脅迫的耐性較弱。