近紅外測定丹參提取濃縮過程中的丹參酮類的含量

張偲偲，王德勤，朱晶晶，李楚源，王智民，匡艷輝*

(1.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣州510515；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700）

復(fù)方丹參片是一種常用的中成藥，用于防治心腦血管疾病[1]，能夠活血化瘀，理氣止痛，用于治療氣滯血淤所致的胸痹，冠心病，心絞痛等病癥[2]。丹參是復(fù)方丹參片中的成分之一，為君藥，需經(jīng)過提取濃縮的工藝以中間體入藥。作為原料藥，丹參提取物的質(zhì)量對產(chǎn)品的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。2015版《中國藥典》中對于復(fù)方丹參片的含量測定，使用高效液相色譜法檢測丹參酮類（檢測指標(biāo):丹酚酸B和丹參酮ⅡA），但采用此法有時(shí)間滯后性，難以快速、高效、實(shí)時(shí)地反映丹參提取濃縮過程中含量的變化情況，不便用于丹參提取濃縮過程中含量的實(shí)時(shí)監(jiān)測和過程控制，從而無法保證相關(guān)過程的可控性。由查閱文獻(xiàn)以及從臨床應(yīng)用的研究中可知，不同廠家之間甚至相同廠家不同批號(hào)之間的復(fù)方丹參片的質(zhì)量和療效的差異很大[3]。因此可知，為了適應(yīng)生產(chǎn)過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控，建立一種快速，高效的過程分析技術(shù)方法是目前大勢所趨。

作為一種間接分析技術(shù)，近紅外（NIR）光譜分析具有樣品處理過程無損簡單、分析過程快速高效、無試劑消耗等特點(diǎn)，已經(jīng)陸續(xù)用于制藥過程藥效成分含量的在線檢測、監(jiān)控、天然藥物鑒別、中藥材的產(chǎn)地鑒別等[4-8]。將NIR技術(shù)應(yīng)用于藥材的質(zhì)量檢測，中藥生產(chǎn)過程的監(jiān)控[9-11]，可實(shí)現(xiàn)入庫、投料和生產(chǎn)過程中的現(xiàn)場快速檢測，從而保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量安全、穩(wěn)定、均一、有效。

本研究基于NIR技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對復(fù)方丹參片生產(chǎn)過程中丹參的提取和濃縮過程中的二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA進(jìn)行定量分析，通過近紅外圖譜建立相關(guān)模型，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程實(shí)時(shí)質(zhì)量控制，為中藥制藥生產(chǎn)過程監(jiān)測方法開發(fā)提供參考思路。

1 儀器及試藥

德國BRUKER-MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀（光源:鹵鎢燈，檢測器:PbS，附漫反射積分球，樣品旋轉(zhuǎn)器和石英樣品杯）；ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色譜系統(tǒng) （美國Waters公司、二極管陣列（PDA）檢測器、柱溫箱、Empower 3色譜工作站）；Milli-Q型超純水制備儀 （美國Millipore公司）；SB25-12DTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）；Satorius BT214D萬分之一分析天平。

乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。對照品二氫丹參酮（批號(hào):A0060，購自成都曼思特生物科技有限公司）；隱丹參酮 （批號(hào):110852-200305），丹參酮Ⅰ（批號(hào):110867-200406），丹參酮ⅡA（批號(hào):110766-200619），均購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定使用。

2 方法

2.1 丹參提取濃縮液制備

參考 《中國藥典》2015年版復(fù)方丹參片中丹參的提取、濃縮工藝條件:稱取2.00kg的丹參飲片，精密稱定，第一次提取時(shí)，加5倍量的95%乙醇加熱回流1.5h，提取液過濾后濾液回收乙醇并濃縮至相對密度1.10～1.20。第二次提取時(shí)，于藥渣加入4倍量的50%乙醇加熱回流1.5h，提取液過濾，濾液回收乙醇并濃縮至相對密度1.10～1.20。第三次提取時(shí)往藥渣加入4倍量的水加熱回流2h，過濾，得到濾液。將三次所得的濃縮液混合并濃縮至相對密度為1.30～1.41。提取過程中，沸騰開始時(shí)取樣，之后每15min取一次樣，每次取樣量為5mL，濃縮過程中，每3min取樣，每次取樣2mL，將取得樣進(jìn)行NIR掃描和UPLC含量的測定。

2.2 NIR光譜采集

NIR測定條件為室溫環(huán)境下測定，選定透射模式Near-IR Transmittance， 掃描范圍12500～4000cm-1，掃描次數(shù):64次，樣品池2mm，分辨率:8cm-1，每個(gè)樣品掃描一次光譜。

2.3 UPLC方法測定二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

ACQUITYHSS-T3? HSST3 1.8μm 2.1×100mm色譜柱；以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動(dòng)相；理論板數(shù)以丹參酮ⅡA不低于30000。梯度洗脫（0～1min,3%～50%A；1～7min，50%～55%A；7～10min,55%～70%A；10～11min，70%～95%A）， 柱溫30℃； 進(jìn)樣量2μL， 流速0.5ml·min-1。 檢測波長為275nm。

2.3.2 對照品溶液的配置

取對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含145μg二氫丹參酮，142μg隱丹參酮，228μg丹參酮Ⅰ，403μg丹參酮ⅡA的混合溶液，即得。

2.3.3 樣品溶液的配置

將提取液樣品直接用0.25μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。將濃縮液稀釋5倍后用0.25μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。其中檢驗(yàn)樣品集為[30min取的95%乙醇提取液 （樣品編號(hào)1），45min取的95%乙醇次提取液（樣品編號(hào)2），9min取的50%乙醇濃縮液（樣品編號(hào)3），12min取的50%乙醇濃縮液（樣品編號(hào)4），15min取的95%乙醇濃縮液（樣品編號(hào)5）]，預(yù)測樣品 集 為 編 號(hào) 為 樣 品6、8、13、33、42、50、56[樣 品6（60min取的95%乙醇的提取液），樣品8（105min取的95%乙醇提取液），樣品13（45min取的50%乙醇提取液），樣品15（90min取的50%乙醇提取液），樣品42（9min取的95%乙醇濃縮液），樣品44（15min取,95%乙醇濃縮液，稀釋5倍），樣品50（3min取的50%乙醇濃縮液），樣品56（18min取的50%乙醇提取液，稀釋5倍）]。

3 結(jié)果和討論

3.1 提取濃縮液中二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的含量測定結(jié)果

建立的二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，線性回歸方程分別為二氫丹參酮Y=7012X-28077(R2=1，n=6)， 隱丹參酮Y=8000X-22714(R2=1,n=6)，丹參酮ⅠY=5018X-58986(R2=1,n=6)，丹參酮ⅡA Y=2268X+12045（R2=1,n=6）。 二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA分別在72.5～725ng、71～710ng、114～1140ng、203～2030ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；精密度實(shí)驗(yàn)顯示二氫丹參酮的RSD為0.54%，隱丹參酮的RSD為0.39%，丹參酮Ⅰ的RSD為2.14%，丹參酮ⅡA的RSD為0.42%，結(jié)果顯示良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示在0、2、4、8、16、24h測定二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的含量的RSD值分別為4.33%，0.72%，4.67%和0.95%；加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示二氫丹參酮的回收率是98.7%（RSD=1.55%），隱丹參酮的回收率97.5%（RSD=1.13%），丹參酮Ⅰ的回收率是90.8%（RSD=0.51%），丹參酮ⅡA的回收率是104.2%（RSD=0.92%）。

3.2 二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的定量分析模型的建立及評價(jià)

3.2.1 樣品集近紅外光譜測定

其掃描得到的光圖譜經(jīng)過SG平滑處理得到以下光譜圖，詳見圖1。

圖1 為丹參樣品的近紅外圖譜Fig1.TheNear-infrared spectra of Salvia miltiorrhiza samples

3.2.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理和數(shù)據(jù)模型構(gòu)建

利用定量分析軟件建立校正模型，采用化學(xué)計(jì)量法將上述不同時(shí)間點(diǎn)收集的樣品經(jīng)掃描所得的光譜圖和測得的UPLC含量值進(jìn)行分析，選定光譜影響值和化學(xué)值誤差Residual剔除測定的異常值，軟件計(jì)算后得出的模型比較RMSECV和R2的大小，選擇光譜范圍和預(yù)處理方法建立4個(gè)較好的校正模型，采用外部驗(yàn)證，并以NIR數(shù)學(xué)模型的主要參數(shù)即R2和RMSECV為指標(biāo)確定最佳模型，結(jié)果見表1，表2，表3，表4。 （軟件為Bruker OPUS6.5/QUANT-2）

表1 不同預(yù)處理方法和譜區(qū)范圍對二氫丹參酮模型的影響Table 1 Effect of different pretreatment methods and spectral region on model ofdihydrotanshinone

表2 不同預(yù)處理方法和譜區(qū)范圍對隱丹參酮模型的影響Table2 Effects of different pretreatment methods and spectral regions on model ofcryptotanshinone

表3 不同預(yù)處理方法和譜區(qū)范圍對丹參酮Ⅰ模型的影響Table 3 Effects of different pretreatment methods and spectral regions on model oftanshinoneⅠ

表4 不同預(yù)處理方法和譜區(qū)范圍對丹參酮ⅡA模型的影響Table 4 Effects of different pretreatment methods and spectral regions on model oftanshinoneⅡA

由以上四個(gè)模型可看出，不同的預(yù)處理方法，在各波段下的光譜范圍不同，線性關(guān)系都較良。

3.2.3 校正模型的驗(yàn)證和最優(yōu)模型的選擇

將檢驗(yàn)樣品集的二氫丹參酮等四個(gè)丹參酮類成分的UPLC測出的含量以及近紅外光譜圖關(guān)聯(lián)到上述四個(gè)模型中，可計(jì)算出真實(shí)值和預(yù)測值之間的相關(guān)系數(shù)以及偏差，以下表5是各成分校正模型對檢驗(yàn)樣本集的預(yù)測結(jié)果相關(guān)系數(shù)和預(yù)測值與真實(shí)值之間的偏差的比較。

通過軟件對四種校正模型中各成分的含量真實(shí)值及預(yù)測值之間進(jìn)行比較計(jì)算，選擇RMSEP和偏差（BIS）最小的模型即為最優(yōu)模型。相關(guān)系數(shù)可見圖2，圖3，圖4和圖5。模型Ⅲ為二氫丹參酮的最佳校正模型；模型Ⅰ為隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的最佳校正模型。

表5 四個(gè)校正模型對檢驗(yàn)樣本集的各成分預(yù)測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)Table 5 The correlation coefficients of four calibration models for the test sample sets

圖2 二氫丹參酮的近紅外測定值和色譜法測定值的相關(guān)系數(shù)圖譜Fig 2 Correlation coefficient image of Near infrared values and UPLC values of dihydrotanshinone

圖3 隱丹參酮的近紅外測定值和色譜法測定值的相關(guān)系數(shù)圖譜Fig 3 Correlation coefficient image of Near infrared values and UPLC values of cryptotanshinone

3.2.4 模型穩(wěn)定性與預(yù)測效果評價(jià)

3.2.4.1 精密度試驗(yàn)

取45min取的95乙醇提取的提取液1份，對該份樣品重復(fù)掃描6次，掃描所得光譜和二氫丹參酮等四個(gè)丹參酮類成分的含量校正模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)，測得二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的含量RSD分別為1.73%，3.01%，2.78%，2.51%。由結(jié)果可知該校正模型精密度良好。

3.2.4.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

圖4 丹參酮Ⅰ的近紅外測定值和色譜法測定值的相關(guān)系數(shù)圖譜Fig 4 Correlation coefficient image of Near infrared values and UPLC values of tanshinon

圖5 丹參酮ⅡA的近紅外測定值和色譜法測定值的相關(guān)系數(shù)圖譜Fig 5 Correlation coefficient image of Near infrared values and UPLC values of tanshinoneⅡA

取45min取的95乙醇提取的提取液樣品6份，分別掃描，掃描所得光譜和二氫丹參酮等四個(gè)成分的含量校正模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)，進(jìn)行計(jì)算。隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的含量RSD分別為1.19%，2.73%，1.64%，1.35%。由結(jié)果可知該校正模型的重現(xiàn)性良好。

3.2.4.3 模型預(yù)測效果的評價(jià)

為了檢測模型是否有效，將模型計(jì)算出的二氫丹參酮等四個(gè)丹參酮類成分的NIR預(yù)測值與UPLC的實(shí)測值進(jìn)行對比，結(jié)果見表6。由表6結(jié)果可知，真實(shí)值和模型校正預(yù)測值的平均偏差均小于5%，說明預(yù)測結(jié)果較為準(zhǔn)確。本次研究所建立的復(fù)方丹參片中二氫丹參酮等四個(gè)丹參酮類成分的含量值相關(guān)性模型預(yù)測性能良好。

表6 丹參酮類成分的NIR預(yù)測值與UPLC的實(shí)測值對比/mg·g-1Table 6 Thepredictability of Tanshinones by NIR compared with that by UPLC/mg·g-1

4 結(jié)論

該研究將NIR分析技術(shù)應(yīng)用于丹參的提取濃縮過程中的二氫丹參酮等四個(gè)丹參酮類成分的含量進(jìn)行分析。建立二氫丹參酮等四個(gè)丹參酮類成分的NIR模型，可用于監(jiān)測丹參提取濃縮過程中上述成分的質(zhì)量變化過程，可用于指導(dǎo)丹參提取濃縮過程的終點(diǎn)，最終實(shí)現(xiàn)復(fù)方丹參片生產(chǎn)過程中的全程實(shí)時(shí)質(zhì)量監(jiān)控及終點(diǎn)判斷，可嘗試用于工廠大生產(chǎn)時(shí)的含量實(shí)時(shí)在線監(jiān)測。當(dāng)需要檢測樣品的時(shí)間或空間條件與建模時(shí)不同，必須用檢驗(yàn)集樣品檢驗(yàn)該模型。如果最終模型的預(yù)測效果降低，真實(shí)值和模型校正預(yù)測值的平均偏差過大，就需要在校正集樣品增加這一檢驗(yàn)樣品，并再次按原步驟修改校正集樣品，穩(wěn)定準(zhǔn)確的模型需要在使用的過程中不斷的維護(hù)與完善。