鹿角蛋白提取及鹿角多肽制備和活性研究

夏廣清，王 巖，張露云，臧 皓*

（1.通化師范學院長白山生物種質(zhì)資源研究院，通化134002；2.通化師范學院生命科學學院，通化134002；3.通化師范學院醫(yī)藥學院，通化134002）

鹿角，是鹿科動物馬鹿或梅花鹿已經(jīng)骨化完全的角，或者將鹿茸鋸掉后，第二年春天脫落下來的角基，功效廣泛且實用，可活血、濕陽、補腎、強筋骨、行氣[1]。鹿角多肽是從鹿角中分離得到的一類分子量在0.2kDa與10kDa之間的具有生物活性的多肽[2]。多肽由于結構比蛋白質(zhì)簡單，可以被細胞直接吸收利用，愈來愈受到研究者的重視[3]。目前多肽的提取主要包括超濾法、層析法、高效液相色譜法和酶解法等，酶解技術是迄今為止最為重要的生物活性多肽方法[4]。本研究以梅花鹿角為原料，采用堿溶酸沉方法對其蛋白進行提取，利用胰蛋白酶水解得到多肽，并對其抗氧化活性和對酪氨酸酶活性抑制作用進行研究，為進一步開發(fā)和利用鹿角多肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥材鹿角購自吉林省通化市老站人參市場。

1.2 試劑

BY0258 Trypsin胰蛋白酶1∶250（合肥博美生物科技有限責任公司）；NA0332 BSA V牛血清白蛋白 （合肥博美生物科技有限責任公司）；ST6700 TPTZ（合肥博美生物科技有限責任公司）；KC0615 Coomassie brilliant Blue G-250（合肥博美生物科技有限責任公司）。

1.3 儀器與設備

Bio Tek Epoch全波長酶標儀（上海菲特科學器材有限公司）；ZW-A微量振蕩器 （金壇區(qū)白塔新寶儀器廠）；FA2204B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）；紫外分光光度計T6型（北京普析通用儀器有限責任公司）。

2 實驗方法與結果

2.1 實驗方法

2.1.1 鹿角蛋白提取

稱取鹿角100g，用手提式多功能藥材粉碎機將原料粉碎，過120目篩，得到鹿角粉末.稱取鹿角粉末20g， 分別加入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mol/L的NaOH和蒸餾水，在50℃恒溫水浴中加熱90min，使蛋白充分溶出，冷卻至室溫后，5000r/min離心10min，所得上清液即為鹿角蛋白提取液。取上清液用0.6 mol/L HCL溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5使蛋白沉淀，5000r/min離心10min，收集沉淀，調(diào)pH值至7.0，經(jīng)真空冷凍干燥后，即得鹿角蛋白。

2.1.2 鹿角蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，具體方法見參考文獻[5]。

2.1.3 鹿角多肽制備

取100mg/ml鹿角蛋白溶液60ml，加入1000U/g胰蛋白酶，在45℃恒溫水浴下分別反應2、3、4、5和6h后，100℃條件下水浴5min，消除酶活性，每一處理重復3次。

2.1.4 鹿角多肽活性測定

采用FRAP法對得到多肽抗氧化活性進行測定，酪氨酸酶抑制活性測定參照裴世春[6]等方法進行測定。

2.2 結果與分析

2.2.1 不同濃度NaOH對鹿角蛋白提取的影響

根據(jù)參考文獻[7-9]，擇優(yōu)選擇料液比1∶10、50℃恒溫水浴90min，考察不同濃度NaOH對鹿角蛋白提取影響，結果見圖1。從圖1可知，當氫氧化鈉濃度由開始的0mol·L-1逐漸增加到1.0mol·L-1時，蛋白質(zhì)含量逐漸增加，但總體增長緩慢，但當氫氧化鈉濃度由1.0mol·L-1增加到1.5mol·L-1時蛋白質(zhì)含量得到了極大的提高，而隨著堿濃度的繼續(xù)增長，蛋白質(zhì)含量增加幅度不大,甚至開始下降。堿濃度在合適范圍內(nèi)增加可以加速鹿角蛋白從鹿角顆粒中的溶出，而過高濃度亦會破壞蛋白質(zhì)表面電荷平衡，影響蛋白質(zhì)分子間相互作用，使得提取液黏度加大，損失大量蛋白質(zhì)，因此選擇堿濃度為1.5mol·L-1時為鹿角蛋白提取的最適條件之一。

圖1 不同濃度NaOH對鹿角蛋白提取影響

2.2.2 鹿角多肽FRAP活性檢測

在蛋白質(zhì)分解為小分子多肽的過程中，酶解時間、pH值、底物濃度、溫度、加酶量均對水解度有著影響，但酶解時間對水解影響比其他幾種因素大很多[10]。不同酶解時間對鹿角多肽抗氧化活性影響見表1及表2。根據(jù)不同濃度Vc對照溶液標準曲線，詳見圖2，得到回歸方程y=4.2293x+0.0698，R2=0.9976，數(shù)值趨近于1，靈敏度高，線性條件好，可靠性強。因此可以將這條曲線作為測定FRAP抗氧化活性能力的標準曲線，該方法用作本實驗評價鹿角多肽是否含有抗氧化能力以及抗氧化活性能力大小的方法。將不同時間鹿角多肽樣品所測得吸光值代入回歸方程可得樣品中抗氧化活性物質(zhì)濃度，即為抗氧化測定還原當量，詳見表1，從表1可知，鹿角多肽具有一定抗氧化能力，且酶解4h時，抗氧化能力最強。

圖2 Vc標準曲線

表1 鹿角多肽抗氧化活性FRAP測定

表2 鹿角蛋白不同酶解時間抗氧化活性

2.3 鹿角多肽對酪氨酸抑制酶活性影響

酪氨酸酶是黑色素形成的關鍵酶，抑制酪氨酸酶活性在一定程度上可減少黑色素的合成，阻止色素沉著從而達到美白作用。利用體外酶活性檢測方法對胰蛋白酶酶解時間得到鹿角多肽活性進行分析，鹿角多肽對酪氨酸酶有一定的抑制作用，詳見表2，且質(zhì)量濃度在50～200μg·mL-1時，對酪氨酸酶的抑制作用呈一定的劑量效關系，隨質(zhì)量濃度的增加，其對酪氨酸酶活性的抑制作用增強，最高抑制率可達131.78酪氨酸UmoL·L-1，說明鹿角多肽具有良好的美白效果.此結果可為利用鹿角多肽開發(fā)化妝品提供基礎性試驗數(shù)據(jù).

表2 鹿角多肽對酪氨酸酶抑制活性研究

3 討論

研究表明，多肽影響著生物體內(nèi)許多重要的生理功能，目前已知有100多種內(nèi)源性生物活性肽參與人體多種生理功能，包括生命活動中的細胞生長、細胞代謝、細胞分化、激素地質(zhì)調(diào)節(jié)、腫瘤病變改善、免疫調(diào)節(jié)、新陳代謝及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等生理活動。此外，多肽還具有抵抗細菌和病毒、提高免疫能力、降血壓、降血脂、抗氧化、抗癌、抗衰老等。由于生物活性肽具備非常好的生理活性與調(diào)節(jié)功能，于是成為了現(xiàn)代科研人員的重點研究對象。但是伴隨著生物活性肽在現(xiàn)代保健醫(yī)療中廣泛應用，如何制備高產(chǎn)率、高活性的生物活性肽成為一大生物難題。

本研究采用堿溶酸成法對鹿角蛋白進行提取，并利用胰蛋白酶對所得鹿角蛋白進行水解得到多肽，抗氧化和酪氨酸水解酶活性實驗結果表明，利用1.5moL·L-1NaOH在pH8.5時，蛋白提取率最高，達0.3913mg/g，1∶2500胰蛋白酶水解4h得到多肽活性抗氧化活性較高，并且表現(xiàn)出一定的酪氨酸酶抑制活性。

近年來，多肽作為治療藥物已越來越受到關注。超過60只多肽藥物已經(jīng)獲得批準上市，并使患者受益，同時還有幾百個新的治療肽處于臨床前和臨床開發(fā)中。多肽藥物具有巨大的商業(yè)價值。本研究通過考察鹿角多肽抗氧化及對酪氨酸酶活性抑制的影響，為鹿角多肽進一步的開發(fā)應用奠定了基礎。未來，我們將繼續(xù)建立在天然肽的優(yōu)勢上，擴大肽的適用范圍。