基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討四逆湯防治阿霉素心臟毒性機(jī)制

盤冰潔，陸彩虹，謝巍，林彩霞，肖萍

（柳州市婦幼保健院，廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)，兒童醫(yī)院，廣西 柳州 545001）

0 引言

阿霉素（doxorubicin）是一種強(qiáng)效、廣譜的抗腫瘤藥，廣泛用于各種實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤，但因其具有心臟毒性的副作用，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制[1,2]。阿霉素引起心臟毒性的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，如氧化應(yīng)激損傷[3]、細(xì)胞自噬[4]、細(xì)胞凋亡[5]等，因此使用單一作用靶點(diǎn)的心臟保護(hù)劑（如B受體阻斷劑、鈣通道阻斷劑）并沒(méi)有取得很好的保護(hù)心臟作用。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、系統(tǒng)調(diào)控的優(yōu)勢(shì)，在防治阿霉素引起的心臟毒性中取得一定的臨床療效[6,7]。

四逆湯是張仲景《傷寒論》中經(jīng)典的回陽(yáng)救逆方，由附子、生姜和甘草組成，在心血管疾病、抗休克、抗腫瘤等疾病均有療效。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，四逆湯在防治阿霉素心臟毒性中取得較好的療效[8-10]，但具體機(jī)制尚未闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是運(yùn)用計(jì)算機(jī)技術(shù)構(gòu)建藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，實(shí)現(xiàn)闡明中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的分析[11]。因此，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以探討四逆湯防治阿霉素心臟毒性的藥理學(xué)機(jī)制。首先收集四逆湯的有效成分并預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)，并收集阿霉素心臟毒性的靶點(diǎn)；然后取兩者的共同靶點(diǎn)進(jìn)行互作關(guān)系分析，以獲取關(guān)鍵靶標(biāo)；最后對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體和通路富集分析，篩選出藥物作用的生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分以及信號(hào)通路，闡明四逆湯防治阿霉素心臟毒性的機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供線索，具體研究流程見(jiàn)圖1。

圖1 研究流程圖

1 資料與方法

1.1 四逆湯有效成分的篩選及靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）收集四逆湯中附子、甘草、生姜的化學(xué)成分，設(shè)定參數(shù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性指數(shù)（drug-like index，DL）≥0.18篩選出四逆湯的有效成分。

1.2 四逆湯作用靶點(diǎn)和阿霉素心臟毒性靶點(diǎn)的收集

利用TCMSP平臺(tái)檢索四逆湯有效成分的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)( Uniprot Database，https://www.uniprot.org/)篩選出物種為“人”的靶點(diǎn)，剔除重復(fù)后獲得四逆湯有效成分的靶點(diǎn)蛋白信息。

運(yùn) 用Genecards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://www.omim.org/）數(shù) 據(jù) 庫(kù)，以“doxorubicin-induced cardiotoxicity”或“adriamycin-induced cardiotoxicity”為關(guān)鍵詞，收集阿霉素心臟毒性的靶點(diǎn)信息。

將四逆湯有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與阿霉素心臟毒性的靶點(diǎn)上傳至Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htmL）得到共同靶點(diǎn)，即四逆湯防治阿霉素心臟毒性的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將收集的四逆湯有效成分及共同靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.1 軟件中，構(gòu)建四逆湯治療阿霉素心臟毒性的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中的點(diǎn)代表藥物成分或者靶點(diǎn)，邊代表藥物成分和靶點(diǎn)之間的相互作用。

1.4 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（http://string-db.org）平臺(tái)，選擇物種為“人”，獲得靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），并通過(guò)Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，獲取度值為前20 的Hub 蛋白。

1.5 靶點(diǎn)GO富集和KEGG富集分析

采用David數(shù)據(jù)庫(kù)( https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05作為篩選條件，獲得四逆湯治療阿霉素心臟毒性的GO富集和KEGG富集結(jié)果，并通過(guò)R軟件對(duì)結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 四逆湯有效成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果

根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18篩選出四逆湯中附子的有效成分21個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)56個(gè)，其中有15個(gè)化合物未找到對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)；甘草的有效成分92個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)238個(gè)，其中有4個(gè)化合物未找到對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)；生姜的有效成分5個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)20個(gè)，其中有1個(gè)化合物未找到對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。通過(guò) Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出物種為“人”的靶點(diǎn)，剔除重復(fù)后共得四逆湯有效成分118個(gè)，靶點(diǎn)243個(gè)。

表1 四逆湯中成分和靶點(diǎn)

2.2 四逆湯防治阿霉素心臟毒性藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)共收集阿霉素致心臟毒性的靶標(biāo)128個(gè)，將阿霉素心臟毒性的靶點(diǎn)與四逆湯的靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，得共同靶點(diǎn)41個(gè)，見(jiàn)圖2。將41個(gè)共同靶點(diǎn)與四逆湯有效靶點(diǎn)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)118個(gè)有效成分中有90個(gè)成分成功比對(duì)，說(shuō)明四逆湯中28個(gè)有效成分沒(méi)有發(fā)揮保護(hù)阿霉素心臟毒性的作用。

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建四逆湯治療阿霉素心臟毒性“藥物—成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。圖中不同顏色代表不同的節(jié)點(diǎn)，黃色代表四逆湯，藍(lán)色代表四逆湯中的有效成分，紫色代表阿霉素心臟毒性，綠色代表共同靶點(diǎn)。由圖可知，四逆湯治療阿霉素心臟毒性呈現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)的特征。

圖2 藥物和疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 “藥物—成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 蛋白相互作用關(guān)系分析

將四逆湯防治阿霉素心臟毒性的41個(gè)共同靶點(diǎn)上傳至STRING 平臺(tái)，得各靶點(diǎn)之間的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，各靶點(diǎn)之間均存在相互作用，無(wú)游離靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4。通過(guò)Cytoscape 軟件中的Cytohubba 插件獲取度值為前20的Hub蛋白，見(jiàn)圖5。

圖4 蛋白互作關(guān)系圖

圖5 四逆湯防治阿霉素心臟毒性的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.4 四逆湯治療阿霉素心臟毒性基因本體（GO）富集分析

為闡明四逆湯防治阿霉素心臟毒性靶點(diǎn)參與的生命過(guò)程，使用 DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)41個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、分 子 功 能（molecular function，MF）以及細(xì)胞組分（cellular component，CC） 富集分析，設(shè)置篩選條件為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05，共富集140個(gè)BP，10個(gè)CC和5個(gè)MF，部分生物學(xué)過(guò)程及細(xì)胞組分、分子功能，見(jiàn)圖6。由此可見(jiàn)，四逆湯治療阿霉素心臟毒性主要參與生物學(xué)過(guò)程為調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞程序性死亡、對(duì)非生物刺激的反應(yīng)、對(duì)有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的反應(yīng)等多個(gè)過(guò)程；細(xì)胞組分包括細(xì)胞質(zhì)、生物膜內(nèi)環(huán)境、膜筏、細(xì)胞器腔等；分子功能包括蛋白質(zhì)二聚化活性、酶結(jié)合、識(shí)別蛋白結(jié)合、抗氧化活性等多種功能。由此可以推測(cè)，四逆湯防治阿霉素心臟毒性是由多途徑協(xié)同作用。

圖6 GO富集分析

2.5 四逆湯治療阿霉素心臟毒性KEGG 通路富集分析

為進(jìn)一步揭示四逆湯防治阿霉素心臟毒性的潛在作用機(jī)制，對(duì)41個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，依據(jù)FDR＜0.05共篩選得17條相關(guān)通路，見(jiàn)圖7。結(jié)果顯示多條通路，包括癌癥通路、胰腺癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、VEGF信號(hào)通路、 黏著斑、小細(xì)胞肺癌、ErbB信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、MAPK信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路。提示四逆湯通過(guò)以上多條通路來(lái)發(fā)揮防治阿霉素心臟毒性的作用。

圖7 GO富集分析

3 討論

鑒于阿霉素具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，越來(lái)越多的研究尋求減輕心臟毒性的方法，例如通過(guò)改變阿霉素的結(jié)構(gòu)或制成脂質(zhì)體制劑或者使用心臟保護(hù)劑[12](Octavia, Tocchetti et al.2012)，然而只有少部分制劑能進(jìn)入臨床試驗(yàn)，而最終能臨床使用則少之又少。中藥復(fù)方按照“君臣佐使”的原則配伍多種草藥或礦物，可以達(dá)到增效的目的，因此越來(lái)越得到研究者的青睞，例如參麥注射液、參芪扶正注射液、參附注射液、生脈注射液、炙甘草湯、生脈飲、四逆湯、益氣活血方、參芪注射液、復(fù)方苦參注射液等[13]。四逆湯具有回陽(yáng)救逆功效，主治心腎陽(yáng)衰寒厥證。研究證實(shí)，四逆湯具有強(qiáng)心利尿、抗休克、增加血流量的作用，可抵抗阿霉素心臟毒性引起的心輸出量不足、水鈉潴留等[14]。研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究四逆湯防治阿霉素心臟毒性的機(jī)制，有助于更好使用本處方。

四逆湯由附子、生姜、甘草三味藥組成?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，附子具有心肌保護(hù)的作用，其總生物堿可以調(diào)節(jié)缺血心肌能量代謝、細(xì)胞修復(fù)和抗氧化自由基等相關(guān)蛋白的表達(dá)[15]；干姜具有改善局部血液循環(huán)的作用，通過(guò)環(huán)氧合酶、脂氧合酶促進(jìn)血管收縮反應(yīng)[16]；甘草具有抗氧化、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，通過(guò)調(diào)控清除自由基、調(diào)節(jié)血脂相關(guān)蛋白而保護(hù)心血管系統(tǒng)[17]，說(shuō)明四逆湯具有多重靶點(diǎn)的作用機(jī)制。本研究共發(fā)現(xiàn)四逆湯在防治阿霉素心臟毒性中發(fā)揮作用的有效成分90個(gè)、靶點(diǎn)41個(gè)，證實(shí)了中藥的多成分、多作用靶點(diǎn)機(jī)制。

關(guān)于四逆湯調(diào)控阿霉素心臟毒性的具體機(jī)制，研究表明其通過(guò)調(diào)控Bcl2、caspase3、caspase9、SOD、MAPK相關(guān)蛋白而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、過(guò)氧化等機(jī)制相關(guān)[18-21]。我們研究發(fā)現(xiàn)，四逆湯調(diào)控Bcl2、BAX、caspase3、caspase9、SOD、MAPK等蛋白表達(dá)，且Capase3、MAPK是關(guān)鍵基因，GO富集分析發(fā)現(xiàn)主要生物學(xué)過(guò)程主要富集與細(xì)胞凋亡、對(duì)刺激的反應(yīng)等，與研究報(bào)道中的凋亡和過(guò)氧化反應(yīng)一致。阿霉素心臟毒性是一種劑量、時(shí)間相關(guān)的毒性反應(yīng)，通過(guò)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、鈣功能障礙、拓?fù)洚悩?gòu)酶II 、線粒體功能受損等機(jī)制使心肌細(xì)胞受損[5,22]。阿霉素通過(guò)活化caspase和降解核小體DNA導(dǎo)致了血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的凋亡[23]， MAPK信號(hào)通路是通過(guò)氧化應(yīng)激觸發(fā)細(xì)胞凋亡的主要中間體[24]。本研究GO富集顯示四逆湯主要通過(guò)凋亡信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)阿霉素心臟毒性的作用，KEGG富集分析顯示主要涉及的信號(hào)通路有caspase和MAPK信號(hào)通路，與現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道相似。除此之外，排名前10的生物學(xué)過(guò)程中，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的有7個(gè)，我們推測(cè)四逆湯在防治阿霉素心臟毒性主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡通路。

綜上所述, 本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法提示四逆湯防治阿霉素心臟毒性涉及多種蛋白功能、多種通路和生物進(jìn)程，體現(xiàn)四逆湯多成分-多靶點(diǎn)-多途徑緩解阿霉素造成的心臟毒性。但是，四逆湯中20個(gè)有效成分未在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，后期我們將結(jié)合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步補(bǔ)充，同時(shí)需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。