聯(lián)合VEGF及CTCs對(duì)乳腺癌新輔助化療療效的評(píng)估及相關(guān)性分析

金小虎，葛一涵，趙毅

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院乳腺科，遼寧沈陽(yáng) 110000；2.上海復(fù)旦大學(xué)大數(shù)據(jù)學(xué)院，上海 200000

乳腺癌作為一種嚴(yán)重威脅女性身心健康的惡性腫瘤，近年來(lái)隨著我國(guó)生活水平的提高，其發(fā)病率與病死率逐年上升[1]。隨著對(duì)乳腺癌疾病進(jìn)展的深入研究，新輔助化療已經(jīng)成為局部中晚期乳腺癌、炎性乳腺癌以及對(duì)外觀有一定需求要求保留乳房患者的首選治療措施。目前，關(guān)于新輔助化療的療效評(píng)價(jià)主要集中于影像學(xué)和查體獲得腫瘤大小變化的直觀證據(jù)。而組織病理學(xué)評(píng)價(jià)是通過手術(shù)或穿刺活檢等方法獲取病灶組織的病理標(biāo)本，觀察腫瘤細(xì)胞殘留情況的有創(chuàng)評(píng)價(jià)體系，對(duì)患者創(chuàng)傷較大，應(yīng)用較少[2]。與之相比，血清學(xué)指標(biāo)具有取材方便，機(jī)體創(chuàng)傷小，可重復(fù)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。因此有效的血清學(xué)指標(biāo)對(duì)于新輔助化療的療效評(píng)估大有裨益。外周血血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是動(dòng)靜脈、淋巴管來(lái)源的血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原。研究表明[3]血清VEGF是早期診斷乳腺癌的有效指標(biāo)。在臨床上，血清VEGF高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，但關(guān)于血清VEGF用于新輔助化療療效評(píng)估的報(bào)道較少。CTCs是因診療操作或某種自發(fā)原因，由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落，通過血管或淋巴系統(tǒng)進(jìn)入機(jī)體外周血循環(huán)中的一種腫瘤細(xì)胞。既往研究[4]證實(shí)CTCs能夠作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的疾病進(jìn)展和總體生存預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。大多被用在發(fā)現(xiàn)癌癥高?；颊卟⒈O(jiān)測(cè)癌癥復(fù)發(fā)方面，但用于新輔助化療療效評(píng)估的報(bào)道較少。該研究選取2018年2月—2019年2月行新輔助治療的30例乳腺癌患者為研究對(duì)象，旨在探討血清VEGF及CTCs與乳腺癌新輔助化療療效的相關(guān)性及血清VEGF與CTCs之間有無(wú)聯(lián)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)選取該院乳腺外科行新輔助治療的30例乳腺癌患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有患者均為女性，年齡52～68歲，平均年齡（56.77±4.36）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①化療前原發(fā)病灶經(jīng)細(xì)針穿刺活檢病理檢查確診為原發(fā)浸潤(rùn)性乳腺癌（炎性乳腺癌除外），腫大淋巴結(jié)經(jīng)細(xì)針穿刺活檢病理檢查確診為轉(zhuǎn)移癌;②新輔助化療前均有可測(cè)量的腫瘤病灶(CT或MR檢測(cè)之病灶≥1 cm,其他檢測(cè)法之病灶≥2 cm);③患者符合新輔助化療適應(yīng)證;④患者既往未接受過化療和大面積放療,治療期間嚴(yán)格遵循治療計(jì)劃,不私自服用與治療無(wú)關(guān)藥物;⑤患者及家屬了解研究?jī)?nèi)容和治療風(fēng)險(xiǎn),愿意接受治療并同意研究調(diào)查;⑥所選病例已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①因自身免疫性疾病或其他原因,長(zhǎng)期服用激素或免疫抑制劑者；②應(yīng)用地塞米松有禁忌證者；③嚴(yán)重精神或神經(jīng)系統(tǒng)疾病，影響知情同意或不良反應(yīng)表述或觀察者；④患者存在肝腎功能異常,心肺功能不全等內(nèi)外科基礎(chǔ)疾病。

1.2 方法

根據(jù)乳腺癌最新化療方案指南,HER-2擴(kuò)增型乳腺癌患者予過表達(dá)型經(jīng)典化療（TCH）方案化療，剩余予以TEC方案化療，所有患者均予6個(gè)周期的化療，持續(xù)靜脈注射，21 d為1個(gè)周期?；颊哂谌朐汉蟠稳粘靠崭钩槿§o脈血3～5 mL，高速離心（3 600 r/min，30 min）后分離血清，取上清液，置于-80℃冰箱保存，留置化療前及化療6周期后血清。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清VEGF水平。試劑盒購(gòu)自北京聯(lián)眾泰克科技有限公司，嚴(yán)格參考說(shuō)明書進(jìn)行操作。CTCs水平檢測(cè)由該院病理科采用免疫熒光染色結(jié)合熒光原位雜交（IM-FISH）獲得。

1.3 觀察指標(biāo)

①新輔助化療6周期后，根據(jù)療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為4組，即CR組、PR組、SD組、PD組。②記錄各組患者化療前、化療6周期后外周血VEGF及CTCs水平。③比較各組患者化療前后外周血VEGF及CTCs的水平差異及其與新輔助化療療效評(píng)估的相關(guān)性。④比較VEGF及CTCs水平之間有無(wú)相關(guān)性。

1.4 療效標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)Recist療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):完全緩解（CR）：可見腫瘤完全消失;部分緩解(PR)：腫瘤最大直徑和最大垂直橫徑相乘縮小大于50%以上，無(wú)新出現(xiàn)病灶;穩(wěn)定(SD)：腫瘤病灶的最大直徑和最大垂直橫徑相乘縮小不足50%，或增大不超過25%;進(jìn)展(PD)：腫瘤的病灶的最大直徑和最大垂直橫徑相乘增加大于25%，或出現(xiàn)新的病灶。臨床緩解率=（完全緩解+部分緩解）例數(shù)/總例數(shù)×100.0%。見圖1。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示。各組數(shù)據(jù)比較前先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布采用配對(duì)t檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布釆用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。采用Spearman分別分析乳腺癌新輔助化療（NCT）前后VEGF、CTCs與新輔助療效有無(wú)相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)分析比較VEGF及CTCs水平之間有無(wú)相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清VEGF水平與新輔助化療療效的相關(guān)性

患者新輔助化療6周期后療效根據(jù)實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，30例乳腺癌患者中，最終觀察CR療效者4例（13.3%），PR療效者20例（66.7%），SD療效者6例（20.0%），PD療效者0例（0.0%）。其中有效組（CR、PR組）化療前血清VEGF水平分別為（324.16±26.11）pg/mL和（237.95±109.56）pg/mL，化療6周期后降為（197.96±59.99）pg/mL和（153.98±82.57）pg/mL,與化療前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.287、8.684，P＜0.05）。新輔助化療無(wú)效組，SD組化療前后血清VEGF水平相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.837，P=0.002）。見表1。其中SD組中有3例在化療3周期后評(píng)估療效為PD，更換化療方案后最終達(dá)到SD療效。采用Spearman分析NCT前后VEGF的差值與新輔助療效發(fā)現(xiàn)VEGF的差值與療效有關(guān)（|rs|=0.591，P＜0.01）。

表1 血清VEGF水平與新輔助化療療效間的關(guān)系[（±s），pg/mL]Table 1 The relationship between serum VEGF levels and the efficacy of neoadjuvant chemotherapy[（±s），pg/mL]

表1 血清VEGF水平與新輔助化療療效間的關(guān)系[（±s），pg/mL]Table 1 The relationship between serum VEGF levels and the efficacy of neoadjuvant chemotherapy[（±s），pg/mL]

時(shí)間有效CR(n=4)PR(n=20)無(wú)效SD(n=6)PD(n=0)化療前化療后t值P值324.16±26.11 197.96±59.99 5.287 0.013 237.95±109.56 153.98±82.57 8.684＜0.001 213.06±112.77 131.28±81.81 5.837 0.002

2.2 CTCs水平與新輔助化療療效的相關(guān)性

有效組（CR＋PR）化療前CTCs水平分別為（4.25±0.83）個(gè)/3.2 mL和（5.90±1.37）個(gè)/3.2 mL，化療6周期后降為（1.25±0.43）個(gè)/3.2 mL和（3.15±1.62）個(gè)/3.2 mL,與化療前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.623、9.491，P＜0.05）;SD組化療前后CTCs水平相比未見明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.348，P=0.235）。見表2。采用Spearman分析NCT前后CTCs的差值與新輔助療效發(fā)現(xiàn)CTCs的差值與療效有關(guān)（|rs|=0.639，P＜0.01）。

表2 CTCs水平與新輔助化療療效間的關(guān)系[（±s），個(gè)/3.2 mL]Table 2 The relationship between the level of CTCs and the efficacy of neoadjuvant chemotherapy[（±s），個(gè)/3.2 mL]

表2 CTCs水平與新輔助化療療效間的關(guān)系[（±s），個(gè)/3.2 mL]Table 2 The relationship between the level of CTCs and the efficacy of neoadjuvant chemotherapy[（±s），個(gè)/3.2 mL]

時(shí)間有效CR(n=4) PR(n=20)無(wú)效SD(n=6) PD(n=0)化療前化療后t值P值4.25±0.83 1.25±0.43 5.623 0.005 5.90±1.37 3.15±1.62 9.491＜0.001 3.00±1.29 4.30±2.05 1.348 0.235

圖1 新輔助化療前后影像資料的對(duì)比Figure 1 Comparison of imaging data before and after neoadjuvant chemotherapy

2.3 血清VEGF水平與CTCs水平在新輔助化療過程中的相關(guān)性

新輔助化療6周期后各組患者VEGF水平均降低，而CTCs有效組水平降低，無(wú)效組水平增加。新輔助化療前后VEGF水平變化與CTCs水平變化相關(guān)（|r|=0.636，P＜0.05）。見圖2。

圖2 新輔助化療前后VEGF水平之差（ΔVEGF）與CTCs水平之差（ΔCTCs）散點(diǎn)圖Figure 2 Scatter plot of the difference between VEGF levels before and after neoadjuvant chemotherapy(ΔVEGF)and the difference between CTCs levels(ΔCTCs)

3 討論

早在1971年福克曼于《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上提出了“腫瘤血管調(diào)控學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為健康人體內(nèi)存在一種血管調(diào)控平衡狀態(tài)，即血管生長(zhǎng)促進(jìn)因子和血管成長(zhǎng)抑制因子，二者之間保持動(dòng)態(tài)平衡。VEGF作為目前已知的作用最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)刺激因子，直接參與腫瘤血管的生成，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。最近一項(xiàng)研究[5]表明乳腺癌TNM分期Ⅲ～Ⅳ級(jí)患者VEGF高表達(dá)的危險(xiǎn)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)的3.1倍，相對(duì)于未發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者VEGF高表達(dá)的危險(xiǎn)是前者的2.3倍。另有一項(xiàng)研究[6]證實(shí)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與VEGF高表達(dá)密切相關(guān)。乳腺癌腫塊直徑＜2.0 cm、2.0～5.0 cm、＞5.0 cm患者的血清VEGF表達(dá)逐漸升高[7]，與該研究中觀察到的結(jié)果一致，即隨著新輔助化療在降低腫塊大小的同時(shí)降低VEGF血清表達(dá)。在該研究中CR組下降幅度比非CR組明顯（P＜0.05）。黃文禎[8]也在研究中發(fā)現(xiàn)CR組下降幅度比非CR組明顯（P＜0.05）。因此，VEGF水平與NCT療效密切相關(guān)。

CTCs是一種實(shí)時(shí)的“液體活檢”標(biāo)志物[9]。已在乳腺、肺、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)。Cristofanilli M等[10]研究表明CTCs計(jì)數(shù)可以有效地將轉(zhuǎn)移性乳腺癌分為兩種不同的亞組類型，惰性Ⅳ期(StageⅣindolent)和侵襲性Ⅳ期(StageⅣaggressive)，被認(rèn)為是晚期疾病分期和疾病分層的重要工具。劉志勇等[11]發(fā)現(xiàn)新輔助化療前CTC s數(shù)量與腫物大小有關(guān)，腫物＞5 cm者CTCs數(shù)量高于腫物≤5 cm者(P＜0.05)。近期一項(xiàng)薈萃分析[12]顯示在NCT前乳腺癌患者CTCs數(shù)量與腫瘤大小有關(guān)(P＜0.01),CTCs計(jì)數(shù)可以提高對(duì)NCT后患者總體生存的預(yù)測(cè)能力。在該研究中，有效組化療6周期后CTCs水平較化療前下降（P＜0.05），有效組化療6周期后CTCs水平明顯低于無(wú)效組（P＜0.05），說(shuō)明CTCs與NCT療效密切相關(guān)。

結(jié)合“腫瘤血管調(diào)控學(xué)說(shuō)”及CTCs，CTCs的形成與血管及淋巴系統(tǒng)聯(lián)系緊密，而VEGF又直接參與血管形成，增強(qiáng)血管通透性以及加速淋巴管的形成[13]。高表達(dá)的VEGF提供了CTCs脫落所需要的血管及淋巴系統(tǒng)。Arai RJ等[14]調(diào)查了節(jié)律性新輔助治療的乳腺癌患者血清VEGF和巨噬細(xì)胞集落刺激因子MCSF的水平發(fā)現(xiàn)，HER2+隊(duì)列中接受曲妥珠單抗治療的患者M(jìn)CSF水平穩(wěn)定，而VEGF呈下降趨勢(shì)。在HER2-隊(duì)列中，未接受曲妥珠單抗治療的患者M(jìn)CSF和VEGF水平呈上升趨勢(shì)。這些結(jié)果提示血管生成途徑參與了新輔助治療中曲妥珠單抗的抗腫瘤作用。最近一項(xiàng)研究[15]表明CTCs檢測(cè)能夠發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者對(duì)HER-2靶向治療是否具有耐受性。血清VEGF及CTCs均與HER2靶向治療密切相關(guān)。該研究通過觀察NCT過程中血清VEGF水平及CTCs水平的變化，發(fā)現(xiàn)30例患者NCT前后VEGF水平變化與CTCs水平變化相關(guān)。這提示血清VEGF水平與CTCs水平相關(guān)。

4 結(jié)論

血清VEGF水平及CTCs水平變化能夠用于評(píng)估新輔助化療療效,為新輔助療效精準(zhǔn)評(píng)估增添一種新的選擇。血清VEGF水平及CTCs水平存在相關(guān)性。