柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)七氟醚致老年大鼠認(rèn)知損害的保護(hù)作用研究

莫蓓，何佩娟，楊垂勛

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2.江西省胸科醫(yī)院，江西 南昌 330006

七氟醚麻醉的好處是患者術(shù)后蘇醒比較快、對(duì)呼吸道的作用很溫和［1］，被廣泛運(yùn)用于老年麻醉。然而近年的研究顯示［2］，老年病人在接受七氟醚麻醉后更容易發(fā)生認(rèn)知方面的問題，經(jīng)方柴胡加龍骨牡蠣湯常用于神經(jīng)疾病的診治中［3-4］。但柴胡加龍骨牡蠣湯是否可用于防治七氟醚麻醉導(dǎo)致的術(shù)后認(rèn)知損害，尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過觀察經(jīng)方柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)七氟醚所致神經(jīng)認(rèn)知障礙的改善作用探討其可能機(jī)制，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為96 只18 月齡SPF 級(jí)老年SD 大鼠，雌雄各半（長沙天勤生物技術(shù)公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：430047000012185），放置在屏障級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)間內(nèi)飼養(yǎng)。

1.1.2 主要藥品 柴胡加龍骨牡蠣湯（漢方醫(yī)藥公司）；七氟醚（濟(jì)南仁源公司）；細(xì)胞裂解液（武漢友聯(lián)特公司）；兔抗鼠NF-κB p65 抗體（南京森貝伽公司）；羊抗兔二抗（杭州格朗瑞公司）；ELISA試劑盒（深圳子科公司）

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、建模及干預(yù) 將所有大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成單純七氟醚組（S 組）、柴胡加龍骨牡蠣湯預(yù)處理組（B 組）、柴胡加龍骨牡蠣湯預(yù)處理對(duì)照組（BC 組）以及空白對(duì)照組（C 組），每組24 只。S 組和B 組建立七氟醚致認(rèn)知損害模型，B 組以及BC 組給予柴胡加龍骨牡蠣湯干預(yù)，C 組對(duì)照。步驟：S 組接受麻醉前1 周，每天采用1 mL/100 g 的生理鹽水進(jìn)行灌胃一次，持續(xù)14 d，此后連續(xù)3 d 吸入2.6%七氟醚+2 L/min 氧氣2 h；B 組麻醉前14 d 每日持續(xù)給予1 mL/100 g 的柴胡加龍骨牡蠣湯懸濁液灌胃（按體表面積折算動(dòng)物給藥劑量），此后連續(xù)3 d 吸入2.6%七氟醚+2 L/min 氧氣2 h。BC 組接受與B 組相同的預(yù)處理，此后連續(xù)3 d 吸入空氣2 h。C 組術(shù)前每天采用1 mL/100 g 的生理鹽水進(jìn)行灌胃一次，持續(xù)14 d，此后3 d 每日吸入空氣2 h。

1.2.2 Morris 水迷宮觀察大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力 將大鼠面向圓形桶壁依次從4 個(gè)象限入水，放一隱藏平臺(tái)，記錄逃避潛伏期。結(jié)束后2 h，撤去平臺(tái)，大鼠游泳120 s，記錄跨臺(tái)次數(shù)。

1.2.3 TUNEL 法觀察海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量 每組選8 只大鼠，取大鼠腦組織，按照TUNEL 試劑盒說明書操作。顯微鏡觀察神經(jīng)元數(shù)量。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)炎癥因子表達(dá) 每組選8只大鼠，取大鼠腦組織，按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測(cè)炎癥因子表達(dá)。

1.2.5 Western blotting 觀察NF-κB p65 表達(dá) 用細(xì)胞裂解液提取海馬組織蛋白，BCA 法蛋白定量；取50 μg 蛋白在SDS-PAGE 上電泳，NF-κB p65 蛋白抗體，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，常溫孵育l h 曝光成像。β-actin 作內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力

1～4 d 時(shí)，S 組大鼠的逃避潛伏期比C 組長（P＜0.05），B 組大鼠逃避潛伏期比S 組短（P＜0.05）。S 組大鼠跨臺(tái)次數(shù)比C 組多（P＜0.05），B 組大鼠跨臺(tái)次數(shù)比S 組少（P＜0.05）。BC 組與C 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 大鼠逃避潛伏期以及跨臺(tái)次數(shù)（）

表1 大鼠逃避潛伏期以及跨臺(tái)次數(shù)（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

2.2 各組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù)

S 組神經(jīng)元數(shù)量比C 組少（P＜0.05）。B 組海馬神經(jīng)元數(shù)量比S 組多（P＜0.05）。BC 組與C 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量（）

表2 大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

2.3 各組大鼠海馬組織中炎癥相關(guān)因子

表3 結(jié)果，S 組炎癥因子水平比C 組高（P＜0.05）。B 組炎癥因子水平比S 組低（P＜0.05）。BC 組與C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)（）

表3 大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

2.4 各組大鼠NF-κB p65 的表達(dá)

表4、圖1 結(jié)果，S 組NF-κB p65 表達(dá)比C 組高（P＜0.05）。B 組大鼠NF-κB p65 表達(dá)比S 組高（P＜0.05）。BC組與C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 大鼠NF-κB p65表達(dá)（）

表4 大鼠NF-κB p65表達(dá)（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

圖1 大鼠NF-κB p65表達(dá)（PAGE電泳圖）

3 討論

七氟醚麻醉可能會(huì)引發(fā)老年病人出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙［5］。海馬是存在于大腦組織一個(gè)部分，目前大量關(guān)于認(rèn)知的研究亦集中于海馬［6-7］。本研究結(jié)果，接受七氟醚麻醉的大鼠逃避潛伏期變長，跨臺(tái)次數(shù)變少，這提示在七氟醚麻醉后大鼠的認(rèn)知的確有障礙，同時(shí)，大鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量也在減少，說明七氟醚對(duì)大鼠的海馬結(jié)構(gòu)亦產(chǎn)生了不利的影響。

老年人在受到應(yīng)激、創(chuàng)傷、麻醉等過程后會(huì)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB 通路的活化，進(jìn)一步加劇中樞和外周炎癥因子表達(dá)，以此來損傷神經(jīng)元細(xì)胞，從而造成認(rèn)知功能障礙［8-9］。在本研究中，NF-κB 通路被激活，NF-κB p65 表達(dá)增多，七氟醚麻醉的老年大鼠腦中IL-1β、IL-6 和TNF-α 顯著高于正常大鼠，提示七氟醚麻醉加劇神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

柴胡加龍骨牡蠣湯是一種傳統(tǒng)中藥方劑，能夠?qū)窦膊∮泻芎玫木徑庾饔茫?］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示［10］，柴胡加龍骨牡蠣湯也能改善阿爾茨海默病模型大鼠的精神狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似，在經(jīng)過此方干預(yù)后，大鼠認(rèn)知明顯改善，同時(shí)，NF-κB p65 表達(dá)下調(diào)，炎癥因子的水平隨之降低，神經(jīng)元數(shù)上調(diào)，提示柴胡加龍骨牡蠣湯會(huì)阻礙NF-κB p65的表達(dá)，抑制炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而減輕對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的傷害而發(fā)揮作用。另外對(duì)正常大鼠使用此方并不會(huì)影響大鼠機(jī)體各項(xiàng)指標(biāo)，提示其安全性也比較可靠。