不同干預(yù)治療對PCOS大鼠血管生成素樣蛋白2表達(dá)的影響

王丹丹 柴淑娟 郭秋炎 衛(wèi)項龍 郭藝紅 申 科 李艷春 趙瑞欽

1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南省鄭州市 450008；2 舞陽縣婦幼保健院生殖科; 3 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡期女性最常見的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病之一，臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)性，表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、無排卵或稀發(fā)排卵、雄激素過多、不少患者伴有胰島素抵抗、血脂代謝異常等[1]，嚴(yán)重影響育齡期女性患者的生活質(zhì)量。目前其病因尚未闡明，深入探討PCOS的生理病理改變及其可能分子機制，尋找治療和預(yù)防的新靶點，一直是生殖內(nèi)分泌研究的熱點。

多數(shù)觀點認(rèn)為全身和卵巢組織局部胰島素抵抗(IR)的存在[2]是PCOS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵病理機制，導(dǎo)致卵巢功能紊亂及排卵異常。PCOS卵巢局部IR主要是因為胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路障礙，可能與胰島素、PI3K及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵分子受損有關(guān)[3-4]。L磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)是一個重要的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，PI3K/AKT信號通路磷酸化減少是PCOS患者胰島素抵抗(IR)的主要特征。卵泡的發(fā)育過程不僅需要激素、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，新生血管提供充足的營養(yǎng)也是卵泡發(fā)育所必需的。血管生成樣蛋白(Angioprotein-like protiens,ANGPTLs)是一類血管生成相關(guān)的分泌性糖蛋白，與血管發(fā)生關(guān)系密切。目前多數(shù)研究認(rèn)為脂肪組織中的ANGPTL2能夠介導(dǎo)脂肪組織慢性炎癥的發(fā)生，促進(jìn)與肥胖相關(guān)的IR[5]。但對于PCOS患者ANGPTL2是否通過PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來介導(dǎo)卵巢組織局部IR從而影響卵泡的發(fā)育目前尚未見相關(guān)的報道。

本實驗研究通過來曲唑建立PCOS大鼠動物模型，應(yīng)用二甲雙胍和中藥分別進(jìn)行干預(yù)，通過適時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Qrt-PCR)檢測PCOS大鼠和中西醫(yī)干預(yù)治療后的卵巢組織中的ANGPTL2、PI3K、AKT以及Foxol的mRNA差異性表達(dá)，探討ANGPTL2是否通過PI3K/AKT信號途徑來影響卵泡的發(fā)育及ANGPTL2與PCOS和胰島素抵抗的相關(guān)性，同時探討中西醫(yī)不同干預(yù)治療對ANGPTL2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 選21d齡雌性SD清潔級大鼠60只，體質(zhì)量180～200g，由鄭州大學(xué)動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK(豫)2015—0005。2019年4—5月底在河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂食。60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法分為空白對照組(NC)10只和實驗組50只，空白對照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，飲水及食物自由攝取，實驗組待造模完成后重新編號根據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠分為模型對照組、西藥組、中藥組(高濃度中藥組、低濃度中藥組)、中藥+西藥聯(lián)合用藥組各10只，實驗過程中飲水及食物自由攝取。

1.2 主要實驗藥物制備 來曲唑(芙瑞)，羧甲基纖維素(sigma公司提供)。補腎化瘀方(沙苑子、枸杞子、菟絲子、茺蔚子、澤蘭、澤瀉、土鱉蟲、丹皮、甘草)藥物由河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中草藥房提供，藥物煎制與濃縮由河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科按照操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，根據(jù)人與大鼠之間用藥劑量換算系數(shù)公式(大鼠劑量=6.3×人的劑量mg/kg)換算實驗給藥劑量。二甲雙胍組4.498mg/ml(等效劑量換算)；補腎化瘀方高濃度組(2倍等效劑量)1.98g/ml，中濃度組(1倍等效劑量)0.989g/ml，低濃度組(1/2倍等效劑量)0.494 5g/ml。

1.3 實驗方法 實驗組大鼠灌胃服用來曲唑1mg/(kg·d)溶于1%羧甲基纖維中，連續(xù)灌胃21d，自造模1周后開始每天觀察大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片。造模結(jié)束后次日開始給藥：空白對照組和模型對照組給予生理鹽水0.01ml/(g·d)灌胃；西藥組給予二甲雙胍溶液0.01ml/(g·d)灌胃；中藥組分別給予高濃度和低濃度補腎化瘀方0.01ml/(g·d)灌胃；中西醫(yī)組分別給予二甲雙胍溶液0.01ml/(g·d)和中濃度補腎化瘀方0.01ml/(g·d)灌胃，連續(xù)灌胃21d。大鼠灌胃21d后，當(dāng)晚8：00禁食，次晨8：00稱重后10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血5～8ml，靜置30min后離心得到血清，-80℃凍存?zhèn)溆?。取大鼠雙側(cè)卵巢組織，一只迅速投入液氮中，2h后置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?，另一只卵巢組織固定于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中以備后續(xù)試驗用。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 血清胰島素水平：采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測血清胰島素水平，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.4.2 卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol mRNA表達(dá)情況：采用研磨法提取mRNA，測定濃度和純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反轉(zhuǎn)錄體系20μl，反轉(zhuǎn)錄條件：50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 30s，60℃ 30s，40個循環(huán)。PCR擴增引物核苷酸序列見表1。

表1 PCR擴增引物核苷酸序列表

1.4.3 卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol 蛋白表達(dá)情況：采用Westen-blot 法檢測卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol 蛋白表達(dá)水平。提取卵巢組織中總蛋白，測定蛋白濃度，根據(jù)總蛋白濃度計算樣品蛋白濃度，將提取的蛋白上清完全變性后-20℃保存。用微量加樣器將制備好的蛋白樣品和MAKER加入上樣孔電泳，各樣品總蛋白量為40μg。在轉(zhuǎn)模槽內(nèi)將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜內(nèi)，然后免疫印跡染色，晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清胰島素含量 與空白對照組相比，其余各組大鼠血清胰島素含量顯著升高(P<0.05)；與模型對照組相比，各治療組血清胰島素水平明顯下降(P<0.05),以中西藥聯(lián)用效果最佳,見表2。

表2 各組大鼠血清胰島素含量

2.2 各組大鼠卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol mRNA及蛋白表達(dá)水平 與空白對照組相比，模型對照組、中藥組及中藥+西藥組大鼠卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型對照組相比，各治療組大鼠卵巢組織中ANGPT L2、AKT、Foxol mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05),西藥組效果最佳，見表3、圖1。

表3 各組大鼠卵巢組織中ANGPT L2、AKT、Foxol mRNA表達(dá)水平

圖1 各組大鼠卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol蛋白表達(dá)水平

3 討論

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PCOS是IR相關(guān)的代謝綜合征，會導(dǎo)致不孕、胰島素抵抗、肥胖和心血管等一系列健康問題，嚴(yán)重影響了育齡期女性生活質(zhì)量，其發(fā)病原因和機制復(fù)雜，研究表明IR 對PCOS患者的生育和代謝功能有顯著的影響，特別是伴有肥胖者，這種影響更大[6]。

血管生成素樣蛋白2(ANGPTL2)是血管生成素樣家族的成員，是一種脂肪組織衍生的分泌糖蛋白[7]。ANGPTL2的主要功能是血管重塑和組織修復(fù)，不過，最近的研究表明過量的ANGPTL2信號介導(dǎo)慢性炎癥以及隨后的病理不可逆組織重塑，推測其可能在PCOS的發(fā)病中起著特殊的作用。本實驗中發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，PCOS組大鼠血清胰島素水平明顯升高，卵巢組織中ANGPTL2蛋白表達(dá)也明顯升高，表明ANGPTL2可能通過影響胰島素的抵抗性，引起卵巢內(nèi)及其周圍脂質(zhì)代謝的異常，從而影響 PCOS患者卵泡的正常發(fā)育。中藥和西藥治療后，各治療組血清ANGPTL2和胰島素水平均有不同程度的下降，表明抑制體內(nèi)ANGPTL2的表達(dá)可以改善體內(nèi)胰島素的敏感性，意味著ANGPTL2可能是PCOS患者發(fā)生胰島素抵抗的一個重要的脂源性感染介質(zhì)，與PCOS的病程發(fā)展關(guān)系密切。Liu Z等學(xué)者曾在PCOS患者的CCMⅡ中檢測ANGPTL1和ANGPTL2基因的差異性表達(dá)，結(jié)果只有ANGPTL2顯著高表達(dá)，說明ANGPTL2可能更能影響PCOS患者顆粒細(xì)胞的成熟發(fā)育[8]。這與本研究結(jié)果相一致。

雖然許多學(xué)者認(rèn)為IR是PCOS發(fā)病的關(guān)鍵因素，但I(xiàn)R并不能解釋PCOS的所有臨床特征?？赡躀R只是PCOS發(fā)病機制的一部分，信號通路改變可能才是PCOS發(fā)病機制的關(guān)鍵因素。PI3K-Akt信號通路的改變與胰島素抵抗(IR)、糖尿病和代謝紊亂密切相關(guān)[9]。ANGPTL2可以通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號途徑對人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用[10]。但ANGPTL2是否也是通過PI3K/Akt信號途徑在PCOS的致病過程中發(fā)揮作用，尚未見此類報道。本研究發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，模型對照組大鼠卵巢組織中與凋亡相關(guān)的Foxol表達(dá)明顯升高，AKT表達(dá)也明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。用二甲雙胍和中西醫(yī)治療干預(yù)后，兩者的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這與ANGPTL2表達(dá)相一致。說明ANGPTL2可能通過PI3K-Akt途徑影響卵泡生發(fā)泡破裂(GVBD)減數(shù)分裂過程[11]，過量ANGPTL2可抑制AKT從而限制GVBD，進(jìn)而影響卵泡發(fā)育[12]。由此可以推測ANGPTL2基因與PCOS的致病過程具有一定的相關(guān)性。

PCOS發(fā)病機制復(fù)雜，臨床異質(zhì)性較大，給診斷和治療帶來很多困難。多數(shù)患者對長期服用激素類藥物心有抵觸，且停藥后容易復(fù)發(fā)，故更愿意接受中藥治療。隨著中醫(yī)對PCOS研究的不斷深入，認(rèn)為腎虛血瘀是PCOS的基本病機[13]，多數(shù)研究已經(jīng)證實補腎化瘀方對多囊卵巢綜合征病例療效顯著。本實驗結(jié)果顯示：與模型對照組相比，各治療組均能不同程度改善PCOS大鼠體內(nèi)IR，并能降低卵巢組織中ANGPTL2水平，在改善IR方面以中西藥聯(lián)合用藥最為明顯，而在降低卵巢組織中ANGPTL2及相關(guān)信號通路方面，則以西藥組最明顯(P<0.05)。推測補腎化瘀方可能減輕卵巢組織局部因血液瘀滯產(chǎn)生的炎癥從而改善胰島素抵抗達(dá)到治療PCOS的目的。但是該方劑使血流通暢的同時是否又促使了新生血管的產(chǎn)生，從而間接引起ANGPTL2的生成增多，具體機制則需要更深一步的研究。

綜上所述，ANGPTL2可能通過PI3K/AKT信號通路，影響凋亡基因表達(dá)和胰島素抵抗，在PCOS的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用，或許血循環(huán)中ANGPTL2水平可成為一種新的監(jiān)控PCOS病程進(jìn)展的小分子物質(zhì)。補腎化瘀方聯(lián)合二甲雙胍可以明顯降低PCOS大鼠體內(nèi)胰島素水平，但是否促進(jìn)ANGPTL2的表達(dá)尚需要進(jìn)一步深入研究。