沙田柚黃龍病近紅外光譜檢測研究

劉福平，王 茜，陳東奎，廖惠紅，黃宏明，張堯良，黃其椿，汪妮娜，張 蘭，董伯年，何東模，施平麗

(1 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)部南寧南亞熱帶果樹科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站/廣西柑桔黃龍病防控工程技術(shù)研究中心，南寧，530007；2 廣西壯族自治區(qū)容縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西容縣，537500)

沙田柚是我國柚類優(yōu)良品種之一[1]，果大形美，風(fēng)味佳，耐貯藏[2]，在廣西、廣東、湖南、四川、浙江和江西均有種植[3]，以容縣沙田柚和梅州金柚最為有名。容縣是沙田柚原產(chǎn)地，被稱為“中國沙田柚之鄉(xiāng)”，容縣沙田柚也是地理標(biāo)志產(chǎn)品[4]。截至2019年，容縣沙田柚種植面積達(dá)1.4 萬hm2(21萬畝)，產(chǎn)量達(dá)22萬t，全縣15個鎮(zhèn)都有種植。近年來，柑桔黃龍病已成為影響沙田柚品質(zhì)和產(chǎn)量的重要因素之一[5]。感染柑桔黃龍病后，沙田柚會出現(xiàn)“黃梢”和斑駁黃化葉，病葉容易脫落，病果變小、畸形、著色不均勻[6]，隨著發(fā)病程度加深，果實(shí)品質(zhì)下降，酸度和異味度顯著提高，失去食用價(jià)值，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值受到嚴(yán)重影響[7]。目前柑桔黃龍病依然無有效防治藥劑，有效防控措施是清除病源和切斷傳播媒介。因此，探究快速、髙效、便攜、適合大規(guī)模使用的田間診斷技術(shù)，對柑桔黃龍病的流行預(yù)警和及時(shí)防控具有重要的生產(chǎn)意義[8]?；诮t外技術(shù)的柑桔黃龍病田間快速檢測方法，具有快速、安全、無損等優(yōu)點(diǎn)[9]。前人針對沙糖桔、臍橙、沃柑、溫州蜜柑等品種，采集葉片近紅外光譜，建立標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫模型并驗(yàn)證，證明了利用近紅外光譜檢測柑桔黃龍病的可行性[8,10-12]。廣州訊動網(wǎng)絡(luò)有限公司開發(fā)了手持近紅外光譜檢測儀，使用其已建立好的沙糖桔黃龍病識別模型對沙田柚黃龍病疑似樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果以Nested-PCR檢測結(jié)果為參照，準(zhǔn)確率低于該模型自身識別率。推測是由不同品種柑桔葉片的近紅外光譜存在差異所致[8]。

筆者從容縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集沙田柚樣品，以Nested-PCR檢測結(jié)果為參照，采用手持式近紅外光譜儀開展沙田柚黃龍病的檢測研究，旨在探索沙田柚黃龍病簡便、準(zhǔn)確的田間快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

沙田柚樣品采自容縣容州鎮(zhèn)、自良鎮(zhèn)、縣底鎮(zhèn)、十里鎮(zhèn)、六王鎮(zhèn)、浪水鎮(zhèn)、松山鎮(zhèn)、石寨鎮(zhèn)等果園。采樣時(shí)間分兩批，第一批采樣時(shí)間為2019年2月，第二批采樣時(shí)間為2019年11月。樣品類型包括無癥狀葉、斑駁黃化葉、均勻黃化葉(主要為黃梢黃化葉)、缺素黃化葉(主要為缺鎂)、其他黃化葉(主要為爛根、損傷導(dǎo)致的黃化葉)，共305株樹，590份樣品。

1.2 儀器設(shè)備

光譜儀器使用廣州訊動網(wǎng)絡(luò)有限公司開發(fā)的手持近紅外光譜檢測儀，采用NGD-HL11模塊，該模塊采用最新的MEMS微鏡技術(shù)原理，波長范圍950～1 650 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集 采集不同果園的葉片樣品。按照果園、樹、癥狀進(jìn)行分區(qū)、編號和分類，采集的葉片樣品要求有代表性。一株樹從不同方位采集癥狀一致的5張葉片歸為一個樣品。

1.3.2 樣品處理與保存 清洗并擦干樣品葉片，使其干凈、無污漬，4 ℃冷藏暫存，采集完光譜的樣品轉(zhuǎn)入-40 ℃低溫冰箱保存。

1.3.3 光譜采集 每片葉采集基部、中部、尾部主葉脈附近3個點(diǎn)，避開支葉脈位置，5片葉共采集15條光譜。

1.3.4 樣品Nested-PCR檢測 取葉片主葉脈每份100 mg，用液氮研磨至粉末狀，放-20 ℃保存待用。采用天根生化科技(北京)有限公司快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)提取DNA[13]，采用黃龍病亞洲種16S rDNA特異引物fD1/fD2和OI1/OI2進(jìn)行Nested-PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測后拍照[14]。

1.3.5 建模及驗(yàn)證 采用2019年11月收集的307份樣品，共4 593條近紅外光譜(因剔除了明顯錯誤的光譜，故實(shí)際利用光譜數(shù)少于原采集光譜數(shù)，下同)，以黃龍病亞洲種Nested-PCR檢測結(jié)果為參照，利用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量分布(SNV)預(yù)處理[10]，在一定程度上減少溫度、水分等因素對葉片光譜的干擾，然后采取偏最小二乘法識別分析(PLS-DA)[12]，將樣品劃分為建模集和檢驗(yàn)樣品集，建模集用于確定近紅外定量模型的參數(shù)，然后采用不參與建模過程的檢驗(yàn)樣品集對優(yōu)選的模型進(jìn)行檢驗(yàn)[10]。根據(jù)模型的可用性來評價(jià)模型預(yù)測未知樣品的能力，本研究采用的評價(jià)指標(biāo)為識別率。識別率(%)=(預(yù)測準(zhǔn)確的近紅外光譜數(shù)/總近紅外光譜數(shù))×100。

1.3.6 不同時(shí)間樣品驗(yàn)證 采用2019年2月283份樣品的4 147條近紅外光譜作為驗(yàn)證集，以Nested-PCR檢測結(jié)果為參照，進(jìn)行模型驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集情況

采集的樣品分別來自輕度感病(柑桔黃龍病)、中度感病、重度感病的沙田柚樹以及未感病但有其他黃化癥狀的沙田柚樹。秋季，輕度感病沙田柚樹，一般在樹的中上部出現(xiàn)一枝到多枝黃梢，黃梢基部葉片出現(xiàn)斑駁黃化，大部分果實(shí)大小、形狀與正常果無差異，水分較少，品嘗后先甜后苦，或出現(xiàn)個別畸形小果，小果的結(jié)果枝葉片黃化，但不表現(xiàn)斑駁癥狀。中度感病沙田柚樹，部分大枝會表現(xiàn)癥狀，老葉斑駁黃化，表現(xiàn)癥狀的大枝長勢明顯衰退，果實(shí)變小，水分變少，入口即有苦味，回酸，但其他未表現(xiàn)癥狀的大枝，果實(shí)大小與正常果差異較小，略有苦味。重度感病沙田柚樹，整株樹嚴(yán)重衰退，大部分老葉明顯斑駁，葉片變小、變脆，易脫落，果實(shí)全部變小，有酸味和異味，失去食用價(jià)值。春季，由于樹體恢復(fù)生長，感染黃龍病的樹整體會返綠，葉片斑駁癥狀較不明顯，但是中度感病和重度感病的沙田柚花苞多，多出現(xiàn)畸形花，新梢少，老葉葉片較少，易脫落。其他采樣沙田柚樹包括表現(xiàn)為缺素(主要為缺鎂)的黃化樹和爛根、損傷造成的黃化樹。

2.2 近紅外光譜建模情況

2019年11月采集的307份樣品近紅外光譜建立的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫模型總識別率81.75%，陽性樣品識別率83.41%，陰性樣品識別率78.80%，假陽性率7.62%，假陰性率10.62%(見表1)。其中，不同癥狀樣品總識別率從高到低依次為斑駁黃化葉96.72%>缺素黃化葉79.67%>無癥狀葉71.57%>均勻黃化葉65.06%>其他黃化葉53.64%；均勻黃化葉和其他黃化葉陰性樣品識別率較低，分別為45.03%和41.38%，即均勻黃化葉陰性樣品有54.97%、其他黃化葉陰性樣品有58.62%被近紅外光譜檢測識別為陽性，是造成結(jié)果假陽性的主要原因；無癥狀葉和缺素黃化葉陽性樣品識別率較低，分別為36.01%和40.00%，即無癥狀葉陽性樣品有63.99%、缺素黃化葉陽性樣品有60.00%被近紅外光譜檢測識別為陰性，是造成結(jié)果假陰性的主要原因；均勻黃化葉和其他黃化葉總識別率較低，進(jìn)而降低了整個模型的總識別率。

表1 柑桔黃龍病手持式近紅外光譜儀模型對秋季不同葉片樣品的識別率

2.3 不同時(shí)期樣品驗(yàn)證情況

利用11月樣品建成的模型去驗(yàn)證2月采集光譜樣品，總識別率64.58%，陽性樣品識別率61.22%，陰性樣品識別率67.09%，假陽性率18.83%，假陰性率16.59%(見表2)。與11月樣品建成模型自身相比，總識別率、陽性樣品識別率、陰性樣品識別率均降低，而假陽性率、假陰性率卻上升；無癥狀葉假陰性率提高16.06個百分點(diǎn)，斑駁黃化葉假陰性率提高7.1個百分點(diǎn)，是致使陽性樣品識別率降低的主要原因；其他黃化葉假陽性率提高14.38個百分點(diǎn)，是致使陰性樣品識別率降低的主要原因。

表2 柑桔黃龍病手持式近紅外光譜儀模型對春季不同葉片樣品的識別率

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，11月經(jīng)Nested-PCR檢測為柑桔黃龍病陽性的無癥狀葉樣品和缺素黃化葉樣品，分別有63.99%和60.00%被近紅

外光譜檢測識別為陰性，分析原因是這部分無癥狀葉帶菌量低，對葉片近紅外光譜影響極小，接近正常葉近紅外光譜；其他黃化葉、均勻黃化葉經(jīng)Nested-PCR檢測為陰性的樣品，分別有58.62%、54.96%被近紅外光譜檢測識別為陽性，分析原因這部分葉片癥狀可能是爛根、樹體損傷等原因所致，其黃化癥狀接近黃龍病菌引起的黃化，近紅外光譜相似。因此，帶菌的無癥狀葉會造成近紅外光譜檢測結(jié)果假陰性，而爛根、損傷導(dǎo)致的其他黃化葉和均勻黃化葉則會造成近紅外光譜檢測結(jié)果假陽性，是致使近紅外光譜模型識別準(zhǔn)確率降低的重要原因，這與王娟等[15]的研究結(jié)果相符。近紅外光譜檢測無損、快速，但在對無癥狀葉、缺素黃化葉、均勻黃化葉、其他黃化葉(爛根、樹體損傷所致)檢測中靈敏度有待提高。

11月樣品建立的模型在用2月樣品進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，總識別率降低，其中陽性樣品識別率下降較多，達(dá)22.19個百分點(diǎn)。分析原因是樣品本身近紅外光譜存在差異，沙田柚感染黃龍病后表現(xiàn)癥狀到11月時(shí)最明顯，在2月時(shí)相對較輕，且2月是樹體恢復(fù)生長時(shí)期，葉片相對秋冬季會返綠，水分增加，光澤度變高，與未感染黃龍病葉片癥狀差異減小，同時(shí)，不同時(shí)間采集近紅外光譜時(shí)外界環(huán)境因素存在差異。因此，不同時(shí)期黃龍病葉片癥狀不同會導(dǎo)致近紅外光譜差異，黃龍病葉片秋冬季癥狀表現(xiàn)最明顯，與未感染黃龍病葉片特征差異最大，含水量偏低[16]，此時(shí)近紅外光譜差異也最大，檢測準(zhǔn)確率較高。近紅外光譜檢測儀采集葉片光譜時(shí)要求較高，會受到外界測量條件光強(qiáng)、水分、灰塵等的干擾[16]，模型在檢測使用時(shí)間、環(huán)境上有局限性。

在王娟等[15]開展的手持式近紅外光譜儀識別沙糖桔黃龍病研究中，黃龍病檢測綜合符合率為78.6%，其中陽性符合率為73.6%，假陽性率為10.7%，陰性符合率為82.5%，假陰性率為10.0%。這與本研究建立的沙田柚標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫模型基本一致，識別率均不算高，離田間使用要求還存在差距。在今后黃龍病近紅外光譜檢測技術(shù)研究中，應(yīng)盡量減少不同時(shí)間樣品癥狀、環(huán)境對其光譜的影響，同時(shí)提高其對帶菌的無癥狀葉、缺素黃化葉和不帶菌的均勻黃化葉和其他黃化葉等的檢測靈敏度，以進(jìn)一步提高其識別率。