酶聯(lián)免疫法測量動物尿液中萊克多巴胺含量的不確定度分析

盧壽康，胡鳳霞，葉惠儀，邱詩婷

（廣東省東莞市萬江農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東東莞 523000）

1 前言

酶聯(lián)免疫法（ELISA）是應(yīng)用在動物尿液、組織或飼料中的萊克多巴胺（瘦肉精）檢測的一種快速篩選方式，隨著近年來萊克多巴胺酶聯(lián)免疫法試劑盒質(zhì)量的提高，能夠定量或半定量測定樣品中萊克多巴胺含量。測量不確定度示表征測量值所處量值范圍內(nèi)的參數(shù)，可以反映數(shù)據(jù)的不確定程度以及可信程度[1-2]，是與現(xiàn)有可利用知識相應(yīng)的最佳值接近程度的一種估計。迪恩生物有限公司提供的質(zhì)檢報告，校正曲線在0～8.1ng／mL范圍內(nèi)精密度為CV為0.36%～5.37%。雖然該方法為萊克多巴胺的篩選方法，但鑒于能夠定量或半定量測定，研究者認為該方法測量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響因素有做合理分析的必要性，應(yīng)該分析尋找主要影響因素并算出其所測結(jié)果的不確定度來對所測結(jié)果做準(zhǔn)確可靠性評估。

萊克多巴胺是動物性食品中常有的激素類添加劑，近幾年我國進出口岸對入境口岸食品中的檢測多次測出萊克多巴胺。正常劑量的瘦肉精藥物進入動物體內(nèi)后可以通過新陳代謝排出，但過量攝入后該激素類添加劑用于動物飼料中后在動物體內(nèi)會有大部分激素殘留，不僅對動物機體有負面影響，對消費者的身體健康也有很大危害。

2 方法

2.1 試驗方法

將萊克多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒在22℃～25℃放置1h以上。豬尿樣以3000rmp/min的速度離心3min。向萊克多巴胺微孔板中加入50μL系列標(biāo)準(zhǔn)/豬尿樣品，立即向所有孔中加入100μL酶標(biāo)工作液，輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘，在22℃～25℃孵育10min，倒出微孔中的液體。將所有微孔放入洗板機中洗板4次，每次每孔用250μL清洗液。將微孔板倒置在吸水紙上，拍干或用脫水儀脫水，加入100μL顯色劑，搖勻反應(yīng)板，22℃～25℃顯色10min，最后加入100μL終止液。10min內(nèi)在酶標(biāo)儀450nm波長下測量吸光度值。

2.2 測定結(jié)果數(shù)學(xué)模型

式中：B為樣品在450nm下的吸光度；

B0為零標(biāo)準(zhǔn)在450nm的吸光度；

x為樣品中萊克多巴胺的濃度，μg/L；

a，b為線性曲線的擬合系數(shù)。

3 不確定度的來源分析

用魚骨圖表示如下：

3.1 移液器加樣引起的不確定度u（fv）

a.加入50μL標(biāo)準(zhǔn)溶液/樣品的不確定度；b.加入100μL酶標(biāo)工作液的不確定度；c.溫度效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度；B類評定，按均勻分布。

3.2 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度u（c）

在0～8.1ng／mL范圍內(nèi)精密度為CV為0.36%～5.37%。包括廠家配液時使用的移液器、溶液溫度變化，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最大允許差所引起的不確定度；B類評定，按均勻分布。

3.3 試劑回收率引起的不確定度u（Rec）

通過迪恩生物有限公司樣品檢測限及回收率實驗（說明書介紹有數(shù)據(jù)）或本實驗室進行樣品檢測限及回收率實驗求得回收率；B類評定，按均勻分布。

3.4 酶標(biāo)儀測定OD值u（f（A））產(chǎn)生的不確定度

依照校準(zhǔn)證書，酶標(biāo)儀在450nm測定范圍0.220-1.342A時，儀器的誤差分別為0.001、0.000A、-0.003A、0.000A；校準(zhǔn)證書上顯示的測量結(jié)果的擴展不確定度U=0.02，k=2。

3.5 樣品重復(fù)測量的不確定度u（RSD）

使用3個梯度的加標(biāo)樣品和1份豬尿樣品分別進行重復(fù)測量8次，A類評定，通過貝塞爾公式計算。

3.6 吸光度與濃度轉(zhuǎn)換引入的不確定度u（f（x））

經(jīng)迪恩生物有限公司ELISA數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)作出“相對吸光度——濃度對數(shù)”擬合曲線，求得擬合曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD值），A類評定，通過最小二乘法計算。

4 不確定度分量的量化

4.1 移液器加樣造成的不確定度u（fv）

4.1.1 移液器容量誤差產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（P）。查JJG646-2006《移液器檢定規(guī)程》可調(diào)式移液器在50μL檢定點的容量允許誤差為±3%，按均勻分布計算，U（P50）在100μL檢定點的容量允許誤差為按均勻分布計算，

4.1.2 溫度效應(yīng)造成的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（T）。按規(guī)定容量器皿的校準(zhǔn)在20℃下進行，水的膨脹系數(shù)為 2.1×10-4/℃，假設(shè)實驗室的溫度在 23.5±1.5℃之間波動。由于溶液在不同溫度下，密度不一樣，體積也發(fā)生變化，根據(jù)溶液的種類及濃度從校正表中查出23.5℃水的補正值A(chǔ)，實際體積

按均勻分布，加樣為49.9655μL、99.931μL由溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.1.3 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度由于u（P）和u（T）相互獨立，故

整個實驗過程中分別有樣品50μL、酶標(biāo)工作液100μL、顯色劑100μL和終止液100μL四步加樣步驟，四者分別是相互獨立的關(guān)系。

4.2 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度u（c）

杭州迪恩生物有限公司提供的質(zhì)檢報告給出的標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0～8.1ng／mL范圍內(nèi)精密度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）CV為0.36%～5.37%），則u（c）=5.37%=0.0537。

4.3 試劑回收率u（Rec）引起的不確定度

浙江迪恩生物科技股份有限公司的提供的說明書，尿液樣品該試劑盒的回收率為90±20%，按均勻分布。則u

4.4 酶標(biāo)儀測定OD值u（f（A））引起的不確定度

MULTISKANFC酶標(biāo)儀在450nm的吸光度示值的最大允差為±0.03A，校準(zhǔn)證書上顯示的測量結(jié)果的擴展不確定度

4.5 樣品重復(fù)測量的不確定度u（RSD）

使用3個梯度（1.1ppb、2.2ppb、5.5ppb）的加標(biāo)樣品和1份豬尿樣品分別進行重復(fù)測量8次，并剔除認為無效的數(shù)據(jù)[6]。表1數(shù)據(jù)顯示，4個樣品測量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD不大于15.1%。鑒于日常檢測中同一樣品做兩次平行測量，以2次測量的平均值作為被測量的估計值，

表1 樣品重復(fù)性測量結(jié)果

4.6 吸光度與濃度轉(zhuǎn)換u（f（x））引入的不確定度

使用杭州迪恩生物有限公司提供的ELISA數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，通過對6組試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測量2次，測得的吸光值，將所有標(biāo)準(zhǔn)品的B/B0在半對數(shù)系統(tǒng)里依次輸入，根據(jù)每個標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的不同濃度，可以得出圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的B/B0值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中能找到對應(yīng)的萊克多巴胺的濃度。通過分析得到萊克多巴胺的線性回歸方程，表示為Y=-0.1507X+0.4938，其中，斜率為-0.1507，截距為0.4938，相關(guān)系數(shù)｜R｜=0.9934，具有良好的線性相關(guān)性[7]。經(jīng)ELISA數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)通過最小二乘法求得曲線的SD值為0.13，

5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

不確定度分量列表于下：

萊克多巴胺相對合成不確定度：

當(dāng)樣品中萊克多巴胺的濃度x為0.2123μg/L時，Ux=urel×x=0.1920×0.2123=0.0408μg/L

6 擴展不確定度

按照慣例，取擴展因子k=2，則擴展不確定度為Uk=Ux×k=0.0408μg/L×2=0.0816μg/L

7 結(jié)果報告

按照農(nóng)業(yè)部1025公告-6-2008《動物性食品中萊克多巴胺殘留檢測酶聯(lián)免疫吸附法》，測定豬尿中萊克多巴胺的平均含量0.2123μg/L，Uk=0.0816μg/L，k=2。