人絨毛膜促性腺激素對母驢促排卵效果的研究

唐斯嘎，韓烏蘭圖雅，娜仁花，馬躍軍，趙俊利，吳海青

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

驢是一種發(fā)情期和妊娠期較長的單胎動物。在生產(chǎn)實(shí)踐中， 準(zhǔn)確掌握母驢的排卵時間以及對其進(jìn)行輸精的時間難度較大。 母驢發(fā)情持續(xù)期平均為（6.0±2.1）d，發(fā)情結(jié)束前（0.7±0.7）d 發(fā)生排卵［1］。 卵泡發(fā)育受下丘腦—垂體—卵巢軸激素協(xié)調(diào)控制， 促卵泡素 （follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促黃體素（luteinizing hormone，LH）在卵泡發(fā)育過程中起協(xié)同作用， 共同促進(jìn)卵泡發(fā)育并排卵［2］。 FSH 與LH 的共同作用對卵泡成熟、雌激素分泌、排卵、黃體生成和維持、孕激素分泌有促進(jìn)功效［3］。 母驢排卵后形成黃體，如果母驢妊娠，其黃體會保持體積和功能；如果沒有妊娠，其黃體會逐漸退化［4-5］。

驢是季節(jié)性多次發(fā)情動物［6］，但繁殖率低，并且卵泡發(fā)育至排卵所需的時間較長， 導(dǎo)致母驢的發(fā)情周期較長，很難準(zhǔn)確把握其排卵時間，容易延誤最佳配種時機(jī)［7］。 精確預(yù)測母驢的排卵時間，可以從根本上提高受胎率。 激素誘導(dǎo)發(fā)情及排卵技術(shù)在提高家畜繁殖效率以及提升畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益中發(fā)揮重要作用。 人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）是一種常用的外源促排卵激素，其作用與LH 相似。 hCG 可促進(jìn)卵泡發(fā)育和成熟， 效果優(yōu)于LH。 hCG 還能促進(jìn)孕酮（progesterone，PROG）和雌二醇（estradiol，E2）的分泌［8-9］，提升卵子質(zhì)量并提高受胎率［10］。該研究通過使用不同劑量的hCG 對母驢進(jìn)行處理，考查對不同直徑卵泡發(fā)育的影響， 并評價對母驢受胎情況及血清生殖激素水平的影響， 為開發(fā)母驢促排卵技術(shù)以及提高母驢繁殖率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點(diǎn)

該試驗于2019 年6—8 月在內(nèi)蒙古草原御驢科技牧業(yè)有限公司驢場進(jìn)行。

1.2 試驗動物

選擇優(yōu)勢卵泡直徑在30～35 mm 以及大于35 mm 的母驢各30 頭。 驢卵巢觀察和卵泡直徑測量工具為獸用B 超儀。 選取的60 頭母驢身體健康、發(fā)情正常、生殖機(jī)能正常。

1.3 試驗分組及處理

將優(yōu)勢卵泡直徑為30 ～35 mm 以及大于35 mm 的2 個群體的母驢各分為3 組（A、B、C 組和D、E、F 組），每組10 頭。 2 個群體各自的3個組別中， 均包括1 個500 IU/頭hCG 處理組、1個1 000 IU/頭hCG 處理組以及1 個不進(jìn)行hCG處理的對照組（見表1）。 采用肌肉注射方法對母驢進(jìn)行hCG 處理。 母驢在試驗期間按正常飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)。

表1 試驗分組及hCG 處理

1.4 卵泡發(fā)育觀察及排卵率測定

各組母驢接受hCG 處理后，每隔24 h 進(jìn)行1次B 超檢查，觀察、測量卵泡直徑并記錄，直到排卵；觀察各組母驢在hCG 處理后不同監(jiān)測時間點(diǎn)的排卵情況，記錄各組發(fā)生排卵的母驢數(shù)量，計算排卵率。

1.5 人工輸精及受胎率測定

對所有試驗?zāi)阁H進(jìn)行人工輸精。 采集驢場配種公驢精液， 將接精杯內(nèi)的精液用消毒后的精液濾紙過濾到31 ℃水浴預(yù)熱的滅菌燒杯內(nèi)，用顯微鏡檢查精液品質(zhì)。 按比例將31 ℃水浴預(yù)熱的稀釋液沿杯口慢慢倒入裝有品質(zhì)合格原精的燒杯。 保定受配母驢，用35 ℃溫開水沖洗外陰3 次，再對外陰部進(jìn)行消毒， 消毒后用35 ℃溫開水沖洗3遍，并用消毒紗布拭干。 輸精時，輸精員站在母驢后側(cè)方，戴消毒一次性長臂手套握住輸精管，五指形成錐形，緩緩送入母驢陰道，捋順宮頸口后將輸精管緩緩送入子宮，穿過子宮頸5～10 cm 處，并輸入精液。 于輸精后第18 天進(jìn)行孕檢。 記錄各組受胎母驢頭數(shù)，計算受胎率。

1.6 血清中E2 和PROG 水平測定

于hCG 處理后0、24、48、72 h 分別對各組母驢進(jìn)行頸動脈采血，每頭采集血樣5 mL，直到排卵。 采血后離心分離血清，并冷凍保存。 利用高效液相色譜法檢測E2和PROG 水平。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 hCG 對母驢卵泡發(fā)育的影響

由表2 可知，總體來看，2 個群體母驢卵泡直徑隨hCG 注射劑量的增加而增大。E 組母驢（優(yōu)勢卵泡直徑大于35 mm）在hCG（1 000 IU/頭）處理后48 h 多數(shù)排卵，未測定。

表2 hCG 處理對母驢卵泡直徑的影響 單位：mm

2.2 hCG 對母驢排卵率的影響

由表3 可知，hCG 處理24 h 后， 優(yōu)勢卵泡直徑為30～35 mm 的母驢 （A、B、C 組） 均未出現(xiàn)排卵；優(yōu)勢卵泡直徑大于35 mm 的母驢群體中，500、1 000 IU/頭hCG 處理組（D 組和E 組）分別有1 頭和2 頭母驢排卵，排卵率分別為10%和20%，而對照組（F 組）母驢沒有排卵，排卵率為0。

表3 hCG 處理對母驢排卵的影響

hCG 處理48 h 后，優(yōu)勢卵泡直徑為30～35 mm的母驢群體中，500、1 000 IU/頭hCG 處理組（A 組和B 組）分別有1 頭和2 頭母驢排卵，排卵率分別為10%和20%，而對照組（C 組）母驢沒有排卵，排卵率為0； 優(yōu)勢卵泡直徑大于35 mm 的母驢群體中，500、1 000 IU/頭hCG 處理組（D 組和E 組）分別有3 頭和4 頭母驢排卵， 排卵率分別為40%和60%，而對照組（F 組）僅有1 頭母驢排卵，排卵率僅為10%。

hCG 處理72 h 后，優(yōu)勢卵泡直徑為30～35 mm的母驢群體中，500、1 000 IU/頭hCG 處理組（A 組和B 組）分別有2 頭和3 頭母驢排卵，排卵率分別為30%和50%，而對照組（C 組）僅有1 頭母驢排卵， 排卵率僅為10%； 優(yōu)勢卵泡直徑大于35 mm的母驢群體中，500、1 000 IU/頭hCG 處理組（D 組和E 組）均有4 頭母驢排卵，排卵率分別為80%和100%，而對照組（F 組）有3 頭母驢排卵，排卵率為40%。

優(yōu)勢卵泡直徑大于35 mm 的母驢， 在接受2個劑量的hCG 處理后，與對照相比，排卵更快。 此外，優(yōu)勢卵泡直徑不同的2 個母驢群體，hCG 處理48 h 后排卵母驢數(shù)和排卵率與對照組相比均有所提高。綜上表明，hCG 處理對母驢具有明顯的促排卵作用。

2.3 hCG 對母驢受胎率的影響

由表4 可知，優(yōu)勢卵泡直徑為30～35 mm 的母驢群體中，500、1 000 IU/頭hCG 處理組（A 組和B組）的受胎數(shù)量分別為3 頭和4 頭，受胎率分別為30%和40%，對照組（C 組）的受胎數(shù)量為3 頭，受胎率為30%。 優(yōu)勢卵泡直徑大于35 mm 的母驢群體中，500、1 000 IU/頭hCG 處理組（D 組和E 組）的受胎數(shù)量分別為4 頭和5 頭， 受胎率分別為40%和50%，對照組（C 組）的受胎數(shù)量為3 頭，受胎率為30%。

表4 hCG 處理對母驢受胎率的影響

總體來看， 在優(yōu)勢卵泡直徑不同的2 個母驢群體中，接受hCG 處理的母驢，受胎率均高于對照組，同時，隨著hCG 劑量的增加，受胎率有所提高。

2.4 hCG 對母驢血清中生殖激素水平的影響

2.4.1 優(yōu)勢卵泡直徑在30～35 mm 的母驢經(jīng)hCG處理后血清中E2 和PROG 水平的變化由圖1可知，接受500 IU/頭hCG 處理的母驢（A 組），血清中E2濃度在處理后0～48 h 內(nèi)呈增加趨勢，而處理后72 h 的血清E2濃度較處理后48 h 時有所降低；接受1 000 IU/頭hCG 處理的母驢（B 組），處理后24 h 的血清E2濃度較0 h 時有較大幅度的提升， 在處理后24～72 h 內(nèi)血清E2濃度呈逐漸下降趨勢；對照組（C 組）的血清E2濃度在0～72 h 內(nèi)基本呈現(xiàn)穩(wěn)步提升的趨勢。

圖1 hCG 處理對優(yōu)勢卵泡直徑在30～35 mm 的母驢血清中E2 水平的影響

由圖2 可知，接受500、1 000 IU/頭hCG 處理的母驢（A、B 組），血清中PROG 濃度在處理后0～72 h 內(nèi)呈逐漸升高的趨勢，而對照組（C 組）的血清中PROG 濃度呈現(xiàn)先降低、后提高的趨勢?？傮w來看，接受1 000 IU/頭hCG 處理的母驢（B 組）血清中PROG 濃度的提升幅度較大。

圖2 hCG 處理對優(yōu)勢卵泡直徑在30～35 mm 的母驢血清中PROG 水平的影響

2.4.2 優(yōu)勢卵泡直徑大于35 mm 的母驢經(jīng)hCG處理后血清中E2 和PROG 水平的變化由圖3可知，接受500 IU/頭hCG 處理的母驢（D 組），血清中E2濃度在處理后24 h 較0 h 時有所提升，在處理后24～72 h 內(nèi)血清E2濃度呈逐漸下降趨勢；接受1 000 IU/頭hCG 處理的母驢（E 組），處理后24 h 的血清E2濃度較0 h 時有較大幅度的提升，在處理后24～72 h 內(nèi)血清E2濃度呈逐漸下降趨勢；對照組（F 組）的血清E2濃度在0～72 h 內(nèi)基本呈現(xiàn)“下降—升高—下降”的變化趨勢，整體變化幅度不大。

圖3 hCG 處理對優(yōu)勢卵泡直徑大于35 mm 的母驢血清中E2 水平的影響

由圖4 可知，接受500 IU/頭hCG 處理的母驢 （D 組）， 血清PROG 濃度在處理后0～48 h內(nèi)呈現(xiàn)逐漸提高的趨勢， 而在處理后48～72 h，血清PROG 濃度趨于平穩(wěn)，基本無變化；接受1 000 IU/頭hCG 處理的母驢 （E 組）， 血清PROG濃度在處理后0～24 h 和48～72 h 均出現(xiàn)較大幅度的提高；對照組（F 組）血清PROG 濃度在0～24 h 有小幅度提升， 在24～72 h 則有較大幅度的提高。

圖4 hCG 處理對優(yōu)勢卵泡直徑大于35 mm 的母驢血清中PROG 水平的影響

3 討論

繁殖率低是影響驢產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題，也是制約驢規(guī)?；⒓s化養(yǎng)殖的主要因素。 目前，驢的繁殖率在40%～60%，遠(yuǎn)低于牛羊，主要原因是驢的繁育技術(shù)體系尚不完善，研究基礎(chǔ)薄弱。同期發(fā)情及胚胎移植等繁殖技術(shù)在牛羊上的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛， 這些技術(shù)利用外源激素對母畜卵泡發(fā)育的促進(jìn)作用，有效提高了母畜生產(chǎn)性能，獲得了顯著的經(jīng)濟(jì)利益。 該研究對繁殖季節(jié)母驢注射外源激素hCG，可有效促進(jìn)優(yōu)勢卵泡發(fā)育及排卵，也有利于提高受胎率。由此可知，hCG 在提升母驢繁殖性能方面具有一定的應(yīng)用潛力。

大量研究證明hCG 可促進(jìn)馬屬動物排卵。 張國庭［11］研究表明，利用hCG 對繁殖季節(jié)卵巢靜止的3 匹母馬進(jìn)行處理，3～7 d 內(nèi)出現(xiàn)發(fā)情的比例為100%；hCG 對于母馬延遲排卵的治療效果優(yōu)于LH 和促排-3 號， 提示hCG 可有效增加卵泡發(fā)育速度，促排卵效果明顯。該研究結(jié)果表明，hCG處理后母驢優(yōu)勢卵泡的直徑明顯增加， 比自然發(fā)育的卵泡發(fā)育速度快，與以上文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致。 Hannan 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)母馬卵泡直徑達(dá)到35 mm 時，注射hCG 可有效促進(jìn)排卵，并提高受胎率。 Sieme 等［13］對卵泡直徑為40 mm 的母馬注射1 500 IU hCG 后，48 h 內(nèi)排卵率為97.5%。Barbacini 等［14］對 卵 泡 直 徑 為35 mm 的 母 馬 注 射2 000 IU hCG 后，48 h 內(nèi)排卵率達(dá)到90%，25～48 h的排卵率達(dá)到75%。 Chang 等［15］研究表明，當(dāng)母驢優(yōu)勢卵泡直徑達(dá)到35 mm 時， 肌肉注射hCG 后，有76%的母驢在24～48 h 內(nèi)排卵。 該研究發(fā)現(xiàn)，在母驢優(yōu)勢卵泡直徑達(dá)到35 mm 時，接受hCG 處理后48 h 內(nèi)排卵率為60%，與以上研究結(jié)果相比較低，可能是由個體差異引起。 張永昌等［16］使用0.2 mg 前 列 腺 素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）對 非 繁殖季節(jié)母驢連續(xù)處理5 d， 第6 天使用500 IU 孕馬血清促性腺激素 （pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）進(jìn)行處理，當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑達(dá)到35 mm 時使用1 500 IU hCG 進(jìn)行處理， 具有較好的促排卵及受胎效果。 這一結(jié)果與該研究結(jié)果有相似之處， 但該研究中未使用PMSG 對母驢進(jìn)行處理，主要原因是PMSG 對母畜的卵巢刺激較大。在該研究中，當(dāng)母驢優(yōu)勢卵泡直徑達(dá)到30 mm 時，對hCG 不夠敏感，可能是該階段影響卵泡發(fā)育的主導(dǎo)激素還是FSH，因此，與LH 功能相似的hCG受到抑制。 結(jié)合以往研究結(jié)果以及該研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，hCG 處理后卵泡排卵明顯比自然排卵快，發(fā)情周期縮短， 表明hCG 可有效提高驢的受胎率，使排卵可控。

雌性動物在排卵前后都會出現(xiàn)E2分泌峰，峰值多出現(xiàn)在排卵前1～4 d 以及排卵后5～10 d。 吳帥帥［17］研究表明，母驢在排卵前2 d 和排卵后7 d各出現(xiàn)一個E2峰值。這與該研究結(jié)果相似。LH 是由腺垂體細(xì)胞分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，可促進(jìn)膽固醇在性腺細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為性激素。 hCG作為LH 的類似物， 可促進(jìn)E2的分泌。 血清中的PROG 水平能反映黃體的活性。 體內(nèi)的PROG 濃度會在排卵后4～6 d 開始增加，在10～17 d 達(dá)到峰值。 當(dāng)PROG 持續(xù)保持在高水平時有助于維持母畜妊娠狀態(tài)。 如沒有發(fā)生妊娠，PROG 濃度開始下降［18-19］。 這與該研究結(jié)果類似：hCG 處理前后母驢血清中PROG 濃度無明顯差異， 但隨著排卵黃體逐漸形成，PROG 濃度在排卵后逐漸升高。 該研究證實(shí)hCG 作為LH 的類似物， 可促進(jìn)E2和PROG的分泌。

馬屬動物因獨(dú)特的卵泡發(fā)育機(jī)制， 導(dǎo)致人工干預(yù)繁殖技術(shù)難度較高。 繁殖技術(shù)人員需精確判斷排卵時間才能有效提高驢的繁殖率。 該研究利用外源激素hCG， 提高了對母驢排卵時間預(yù)測的精確度，具有一定的應(yīng)用潛力。