針刀療法對(duì)肩周炎模型兔局部組織IL-1β、TNF-α和ASIC1表達(dá)的影響

周丹,張照慶,尹晶,王小飛,金瑋,武歡

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢 430061;2.武漢市第三醫(yī)院,武漢 430061)

肩關(guān)節(jié)周圍炎簡(jiǎn)稱肩周炎,以活動(dòng)時(shí)肩部疼痛及活動(dòng)受限、功能障礙為主要臨床表現(xiàn),嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,多見于50歲左右的成人,又稱“五十肩”“肩凝證”“漏肩風(fēng)”[1]。目前對(duì)肩周炎的臨床癥狀及相應(yīng)的治療方法研究頗多,但肩周炎發(fā)生的病因及病理機(jī)制尚不明確,且臨床上對(duì)該病有效治療方案尚無共識(shí)[2-3]。大量臨床研究[4-7]證實(shí),針刀療法治療肩周炎具有臨床療效顯著、適用廣泛且費(fèi)用較低的特點(diǎn)[8-9]。通過動(dòng)物模型探索肩周炎發(fā)病機(jī)制及針刀療效的分子機(jī)制,有助于為肩周炎臨床治療方案的發(fā)展提供思路,然而目前相關(guān)研究較少。白介素(interleukin, IL)-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α為促炎性細(xì)胞因子,與炎癥發(fā)生、組織損傷和充血水腫有關(guān);酸敏感離子通道 1(acid-sensing ion channel 1,ASIC1)則通過調(diào)節(jié)痛覺感受神經(jīng)元的功能,導(dǎo)致牽涉痛和機(jī)械性痛覺產(chǎn)生[10]。本研究通過觀察針刀松解法對(duì)肩周炎家兔模型局部組織形態(tài)學(xué)和病理學(xué)改變以及IL-1β、TNF-α和 ASIC1表達(dá)水平的影響,探索針刀療法對(duì)肩周炎干預(yù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)健康雄性新西蘭兔 30只,體質(zhì)量(2.5±0.5)kg,購(gòu)于武漢市萬千佳興生物科技有限公司,動(dòng)物使用許可證號(hào)為 SCXK(鄂)2016-0011,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢市第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(批件號(hào)為武三醫(yī)實(shí)倫SY2019-010)。家兔飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為室溫(23～25) ℃,相對(duì)濕度 50%～62%,光照強(qiáng)度和明暗交替時(shí)間按照 GB9425-2001標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。將 30只健康雄性新西蘭兔適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,按照隨機(jī)數(shù)字表法將家兔分為空白組、模型組、針刀組3組,每組10只。

1.2 主要試劑與儀器

一次性針刀(0.6 mm×40 mm,北京中研太和醫(yī)療器械有限公司,貨號(hào) 100PCS);蘇木素染液(美國(guó) ASPEN,貨號(hào) AS1055A)、伊紅染液(美國(guó) ASPEN,貨號(hào)AS1094);TRIpure Total RNA Extraction(武漢 ELK,貨號(hào) EP013),EntiLink? 1st Strand cDNA Synthesis Kit(武漢 ELK,貨號(hào) EQ003),EnTurbo? SYBR Green PCR SuperMix(武漢ELK,貨號(hào)EQ001);基因擴(kuò)增儀(杭州博日,型號(hào) TC-XP);熒光定量 PCR儀(美國(guó) Life technologies, 型號(hào)StepOne? Real-Time PCR System);IL-1β(北京 Bioss,貨號(hào) bs-20448R)、TNF-α(美國(guó) Abcam,貨號(hào) ab6671)、ASIC1抗體(武漢ELK,貨號(hào)ES8643),羊抗兔HRP-二抗(美國(guó)ASPEN,貨號(hào)AS1107);SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(美國(guó)ASPEN,貨號(hào)AS1012),RIPA總蛋白裂解液(美國(guó) ASPEN,貨號(hào)AS1004),BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó) ASPEN,貨號(hào)AS1086),ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(美國(guó)ASPEN,貨號(hào) AS1059),顯影定影液(美國(guó) ASPEN,貨號(hào)AS1027);0.45μm PVDF 膜(美國(guó) Millipore,貨號(hào)IPVH00010);柯達(dá)醫(yī)用 X射線膠片(日本 Kodak,貨號(hào)XBT-1);酶標(biāo)儀(江蘇Diatek,型號(hào)DR-200Bs)。

1.3 模型制備與鑒定

空白組正常飼養(yǎng),模型組及針刀組家兔右肩部外側(cè)脫毛,面積為6 cm×6 cm。家兔呈俯臥位,將其后肢和左前肢固定于兔臺(tái),右前肢上臂固定于水平搖床。設(shè)置搖床搖動(dòng)頻率為240次/min,振幅為1.5 cm,平行搖動(dòng)家兔右肩關(guān)節(jié),每天持續(xù)固定搖晃4 h,連續(xù)3 d。每日機(jī)械搖晃后即刻將自制冰袋放于家兔右肩部冰敷,冰敷時(shí)將兔固定于兔盒,并在冰塊融化時(shí)重復(fù)更換新冰袋,每天持續(xù)4 h[11]。連續(xù)3 d后觀察兔右前肢形態(tài)變化,當(dāng)兔右前肢呈“外翻”狀態(tài),運(yùn)動(dòng)受限,主動(dòng)爬行時(shí)身體傾斜,并出現(xiàn)右肩關(guān)節(jié)活動(dòng)不利、疼痛反應(yīng)增強(qiáng),并且局部軟組織均輕度腫脹,肉眼可見不同程度充血或瘀斑時(shí),提示肩周炎模型兔造模成功[12]。

1.4 干預(yù)方法

空白組及模型組兔不接受任何干預(yù)手段,回籠繼續(xù)飼養(yǎng)。針刀組兔接受針刀治療,造模成功后第 2、8、15和22天,固定兔模型于兔臺(tái),仔細(xì)觸診模型兔右肩關(guān)節(jié),常規(guī)碘伏消毒,定位喙突外緣、岡上肌腱大結(jié)節(jié)和結(jié)節(jié)間溝處,針刀縱疏橫剝2刀,若附近區(qū)域觸及陽(yáng)性反應(yīng)點(diǎn),則一并針刀松解2刀,以松為度[11]?？焖俪鲠樀?無菌紗布?jí)K按壓1 min,防止出血,再次消毒后用無菌敷料貼扎。每周治療1次,共治療4周,隨后進(jìn)行行為學(xué)觀察。

1.5 標(biāo)本采集

用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔后迅速剝?nèi)∮覀?cè)肩關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織,取下關(guān)節(jié)滑膜囊及周圍組織,在冰面上用0.9%生理鹽水漂洗干凈,取大小為2 cm×2 cm×0.3 cm關(guān)節(jié)滑膜囊組織,于20%多聚甲醛溶液中固定1周,用于病理組織切片 HE染色;另外取大小約 1 cm×1 cm關(guān)節(jié)滑膜囊及周圍組織,液氮速凍24 h后,在－80 ℃冰箱保存,用于RT-qPCR和Western blot檢測(cè)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 肩關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察

將新鮮局部肩關(guān)節(jié)滑膜組織置于 4%多聚甲醛中固定 1周,組織從固定液取出后將目的部位組織修平整,經(jīng)過脫水機(jī)內(nèi)依次梯度乙醇脫水、包埋、切片、攤片機(jī)展平、石蠟切片脫蠟至水、蘇木素染細(xì)胞核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)以及脫水封片步驟后,采用光學(xué)顯微鏡觀察各組新西蘭兔右側(cè)肩關(guān)節(jié)囊滑膜肌組織病理形態(tài)。采用Image J 和Image Pro Plus v6.0圖像處理軟件分析圖片。

1.6.2 肩關(guān)節(jié)滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和ASIC1 mRNA檢測(cè)

采用無 RNA酶工具從液氮中取約 100 mg組織,于1 mL預(yù)冷的TRIpure溶液中充分研磨,勻漿液小心倒入 1.5 mL EP管中,加入 250 μL三氯甲烷溶液,充分混勻,冰上靜置5 min。在4 ℃下以12 000 r/min離心 10 min。于超凈工作臺(tái)中小心吸取上清 500 μL于1.5 mL EP管中,加入等體積4 ℃預(yù)冷的異丙醇溶液中,顛倒混勻,于－20 ℃冰箱靜置 15 min后離心,4 ℃,12 000 r/min,10 min,小心倒掉液體,加入 1 mL 4 ℃預(yù)冷 75%乙醇,顛倒數(shù)次,離心清洗 RNA沉淀,4 ℃,12 000 r/min,5 min,棄液體。將沉淀置于超凈工作臺(tái)干燥數(shù)分鐘后,加入10 μL RNase-Free水,充分溶解RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)說明書設(shè)置總反應(yīng)體系為20 μL,PCR儀設(shè)定為37 ℃ 60 min,85 ℃5 min,4 ℃。進(jìn)行熒光定量 PCR,反應(yīng)體系成分為2×Master Mix(5.0 μL),2.5 μM引物工作液(1.0 μL),Template(1.0 μL),ddH2O(2.0 μL)以及Rox(1.0 μL),引物序列見表 1。反應(yīng)程序設(shè)置為預(yù)變性95 ℃,3 min;循環(huán)95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃30 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線采用儀器默認(rèn)設(shè)置。數(shù)據(jù)分析方法采用ΔΔCT法,即A＝CT(目的基因,實(shí)驗(yàn)樣本)－CT(內(nèi)標(biāo)基因,實(shí)驗(yàn)樣本),B＝CT(目的基因,對(duì)照樣本)－CT(內(nèi)標(biāo)基因,對(duì)照樣本),K=A－B,表達(dá)倍數(shù)=2﹣κ。

表1 各檢測(cè)指標(biāo)引物序列

1.6.3 肩關(guān)節(jié)滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和 ASIC1蛋白檢測(cè)

組織塊用 PBS漂洗去除血污,剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的蛋白提取試劑,冰浴勻漿。4 ℃,12 000 r/min,離心 5 min,收集上清,即為總蛋白溶液。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度,根據(jù)樣品濃度確定上樣量,保證每個(gè)樣品總蛋白上樣量均為 40μg。在蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃沸水浴5 min。配制分離膠、濃縮膠,按濃縮膠 80 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳。從正極到負(fù)極擺放轉(zhuǎn)膜“三明治”結(jié)構(gòu),擺放過程避免氣泡產(chǎn)生,設(shè)置300 mA恒流轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜置于封閉液封閉,37 ℃,1 h。隨后除去封閉液,加入稀釋好的一抗(稀釋比例 IL-1β為1:500,TNF-α和 ASIC1為1:1000),4 ℃,孵育過夜,回收一抗,用TBST清洗3次,每次5 min。加入稀釋好的二抗(稀釋比例為 1:10 000),室溫下孵育 30 min,用TBST于搖床上清洗4次,每次5 min。滴加ECL溶液于膜上,暗室中進(jìn)行曝光,顯影、定影。以GAPDH為內(nèi)參測(cè)定IL-1β、TNF-α和ASIC1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,根據(jù)數(shù)據(jù)是否符合方差齊性分別采用單因素方差分析(One Way-ANOVA)(組間比較采用Tukey檢驗(yàn))或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallistest)(組間比較采用Dunn’s檢驗(yàn))。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組肩關(guān)節(jié)周圍組織肉眼觀察

空白組家兔肩關(guān)節(jié)形態(tài)正常,未見腫脹,打開關(guān)節(jié)腔無積液。模型組家兔肩關(guān)節(jié)周圍組織充血腫脹明顯,周圍肌肉有肥厚、機(jī)化、粘連,打開關(guān)節(jié)腔時(shí)有大量黃色積液流出。針刀組家兔肩關(guān)節(jié)周圍組織腫脹情況、周圍肌肉肥厚和粘連情況較模型組輕,打開關(guān)節(jié)腔時(shí)僅有少量黃色積液流出。

2.2 3組肩關(guān)節(jié)周圍組織病理學(xué)改變

光鏡下觀察肩關(guān)節(jié)周圍組織HE染色切片,空白組滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松,可見少量毛細(xì)血管,肌腱外膜上皮細(xì)胞和肌腱纖維排列整齊,無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);模型組滑 膜上皮層毛細(xì)血管增多,滑膜中有纖維素滲出并和周圍組織粘連,肌腱外膜上皮細(xì)胞增生且排列不整齊,肌纖維部分?jǐn)嗔?肌間質(zhì)中纖維素滲出、機(jī)化和結(jié)締組織增生,且肌間質(zhì)中有紅細(xì)胞滲漏,未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);針刀組滑膜細(xì)胞排列同正常組,可見少量毛細(xì)血管,肌腱外膜上皮細(xì)胞輕微增生,肌腱纖維致密,排列整齊,未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。表明針刀療法可以改善肩周炎模型兔病理學(xué)改變。詳見圖1。

圖1 3組家兔肩關(guān)節(jié)周圍組織病理形態(tài)比較

2.3 3組肩關(guān)節(jié)滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和ASIC1 mRNA表達(dá)水平

與空白組比較,模型組家兔肩關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、TNF-α和 ASIC1 mRNA表達(dá)水平均顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較,針刀組肩關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、TNF-α和 ASIC1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與空 白組比較,針刀組肩關(guān)節(jié)滑膜組織中 IL-1β和ASIC1 mRNA表達(dá)水平顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明針刀療法可以顯著減少肩周炎模型兔IL-1β、TNF-α和和ASIC1的mRNA表達(dá)水平。詳見表2。

表2 3組家兔肩關(guān)節(jié)滑膜中 IL-1β、TNF-α和 ASIC1 mRNA表達(dá)水平(±s)

表2 3組家兔肩關(guān)節(jié)滑膜中 IL-1β、TNF-α和 ASIC1 mRNA表達(dá)水平(±s)

注:與空白組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別空白模型針刀別白組型組刀組n 10 10 10 1 2 1 IL-1β 1.03±0.247 2.93±0.4581)1.87±0.3391)2 1.3.2) 1.TNF-α 13±0.226 73±0.6781)81±0.2442)AS 1.03±3.27±2.11±SIC1±0.312±0.2401)±0.1561)2)

2.4 3組肩關(guān)節(jié)滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和 ASIC1蛋白表達(dá)水平

與空白組比較,模型組家兔肩關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、TNF-α和 ASIC1蛋白表達(dá)水平均顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較,針刀組肩關(guān)節(jié)滑膜組織中 TNF-α和和ASIC1蛋白表達(dá)水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與空白組比較,針刀組肩關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α和 ASIC1蛋白表達(dá)水平均顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明針刀療法可以顯著減少肩周炎模型兔 IL-1β、TNF-α和ASIC1的蛋白表達(dá)水平。詳見圖2、表3。

圖2 3組肩關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、TNF-α和 ASIC1蛋白條帶圖

表3 3組肩關(guān)節(jié)滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和ASIC1蛋白表達(dá)水平(±s)

表3 3組肩關(guān)節(jié)滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和ASIC1蛋白表達(dá)水平(±s)

注:與空白組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別空白模型針刀別白組型組刀組n 10 10 10 IL-1β 1.00±0.05 5.85±0.151)2.53±0.14 1.4.1.TNF-α 00±0.17 13±0.181)79±0.221)2)AS 1.00±0.15 6.27 3.07 SIC1±0.281)±0.711)2)

3 討論

肩周炎是軟組織退行性與炎癥性病變,其基本病因是肩關(guān)節(jié)周圍軟組織的廣泛粘連、瘢痕和無菌性炎癥。針刀能夠?qū)珀P(guān)節(jié)周圍的肌腱韌帶等軟組織的粘連、攣縮和瘢痕等進(jìn)行橫向剝離和縱向疏通,其作用機(jī)制包括松解粘連,改善循環(huán),解除粘連和機(jī)化瘢痕對(duì)感覺神經(jīng)末梢的牽拉、機(jī)械性壓迫等[13]。從中醫(yī)學(xué)角度來講,“痛則不通,通則不痛”,小針刀療法將針刺療法的“針”和手術(shù)療法的“刀”有效結(jié)合,通過針刀松解可以平衡陰陽(yáng)、活血通氣、疏通經(jīng)絡(luò),達(dá)到松解肌肉痙攣、疏通氣血的效果,從而治療肩周炎[14]。

IL-1β和TNF-α是機(jī)體在組織損傷、感染或炎癥過程中釋放的關(guān)鍵細(xì)胞因子,具有廣泛的促炎活性,能夠活化中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞,誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)、趨化因子和超氧化物的釋放[15-16]。IL-1β和TNF-α可直接或間接作用于傷害性感受器,通過增加神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上P物質(zhì)和前列腺素E2的表達(dá)水平參與外周敏化[17],因此在持續(xù)性疼痛或病理性疼痛中起到重要作用[18]。其中,IL-1β不僅可以直接作用于傷害感受器或通過間接作用,誘導(dǎo)其他傷害性分子釋放以促進(jìn)炎癥反應(yīng),參與外周敏化[19],而且可以參與中樞水平的痛覺敏化[20],并且與嗎啡的耐受有關(guān)[21]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),針刀干預(yù)可以降低肩周炎模型兔 IL-1β的表達(dá)水平[22]。ASICs屬于上皮細(xì)胞鈉通道/退化蛋白(epithelial Na﹢channel/degenerin, ENaC/DEG)超家族離子通道,是感覺神經(jīng)元中酸的主要傳感器,在痛覺和機(jī)械感覺的傳導(dǎo)中起到關(guān)鍵作用[23]。無氧代謝誘導(dǎo)的乳酸和質(zhì)子的累積會(huì)激活傷害性感受器,而ASICs的激活能夠敏化傷害性感受器[23]。當(dāng)組織受傷或發(fā)炎時(shí),背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中 ASIC1基因水平表達(dá)增加[24]。大量研究發(fā)現(xiàn),肩周炎患者肩關(guān)節(jié)囊IL-1β和TNF-α等炎癥因子[25-27]以及 ASIC1[28]表達(dá)水平增加,因此這3個(gè)指標(biāo)被認(rèn)為是與肩周炎有關(guān)的生物標(biāo)志物[29]。綜上所述,IL-1β、TNF-α和 ASIC1可能通過介導(dǎo)了炎性疼痛中的炎性痛敏反應(yīng),導(dǎo)致肩周炎炎癥和疼痛反應(yīng)的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,針刀療法可顯著改善肩周炎模型家兔肩關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)改變,降低 IL-1β、TNF-α和ASIC1基因與蛋白的表達(dá)水平。由此可推測(cè),針刀松解術(shù)治療肩周炎的作用機(jī)制可能為,改善局部組織病理變化,促進(jìn)組織的修復(fù),減少肩關(guān)節(jié)滑膜組織中促炎因子IL-1β、TNF-α和酸感受器ASIC1的釋放,減輕局部組織炎癥反應(yīng)和痛敏反應(yīng),通過抗炎鎮(zhèn)痛對(duì)肩周炎起到治療作用。

綜上所述,針刀療法治療肩周炎,可能是通過減少局部組織促炎因子釋放,起到消炎鎮(zhèn)痛的作用實(shí)現(xiàn)的。