多酶催化制備海藻糖及分離提取工藝優(yōu)化

宋龍祥,張欣宜,王 沖,劉洪玲,王騰飛

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,濟南 250353

海藻糖是由兩個α-D-葡萄糖通過α,α-1,1-葡萄糖苷鍵形成的非還原性雙糖[1]。海藻糖廣泛存在于動物、植物、微生物體內(nèi)[2]。海藻糖具有理化性能穩(wěn)定、無色無臭、口感略甜、熱值低、不易焦糖化、保護生物大分子活性等特性,在疫苗、藥品、食品、生物大分子的保護劑等方面具有廣泛的應(yīng)用價值[3-5]。

雙酶轉(zhuǎn)化法是以淀粉或麥芽糊精為底物,利用麥芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase)和麥芽寡糖基水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase)轉(zhuǎn)化為海藻糖[6-8]。雙酶法具有轉(zhuǎn)化率高、操作簡單等特點。但酶轉(zhuǎn)化液中含有大量的中間轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,如葡萄糖、麥芽糖、麥芽寡糖等[9]。制備高純度食品級或醫(yī)藥級海藻糖必須去除酶轉(zhuǎn)化液中的中間產(chǎn)物。膜分離技術(shù)是利用具選擇透過特性的過濾介質(zhì)對物質(zhì)進行分離純化的技術(shù),具有高效、低耗、環(huán)保、操作條件溫和、可連續(xù)操作等特點,廣泛應(yīng)用在食品多糖生產(chǎn)中,如魔芋寡糖[10]、山梨醇[11]、赤蘚糖醇[12]、猴頭菇多糖[13]等產(chǎn)品的分離提純和濃縮中。

利用MTSase和MTHase雙酶法轉(zhuǎn)化制備海藻糖粗糖液,將獲得的海藻糖粗糖液經(jīng)糖化酶糖化后,再通過陶瓷膜組件、超濾膜組件、活性炭脫色等預(yù)處理,最后用MWCO 250納濾膜組件將海藻糖和葡萄糖進行分離獲得海藻糖糖液。通過探究海藻糖轉(zhuǎn)化優(yōu)化、納濾分離的工藝條件,為海藻糖的制備與分離純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糖化酶、普魯蘭酶:諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；MTSase和MTHase酶液:本實驗室所有；乙腈:上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；麥芽糊?DE 8.0):本實驗室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

卷式膜多功能小設(shè)試備:廈門福美科技有限公司；復(fù)合卷式納濾膜MWCO 250.00:美國GE公司；安捷倫液相色譜儀:安捷倫(中國)公司。

1.3 檢測方法

海藻糖的檢測:葡萄糖和海藻糖的濃度由HPLC檢測[14]。色譜柱:NH2鍵合相柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)；流動相:V(乙腈)∶V(水)=3∶1；流速:1 mL/min；柱溫:40 ℃；檢測器:示差折光檢測器(RID-10A),檢測池溫:40 ℃。

1.4 實驗方法

1.4.1 海藻糖轉(zhuǎn)化優(yōu)化

以20%的麥芽糊精(DE 8.0)為底物,探究普魯蘭酶添加量(0～20 U/g)、溫度(50～70 ℃)、pH(4.5～7.5)、MTSase(65～115 U/g)和MTHase(25～65 U/g)添加量、轉(zhuǎn)化時間以及糖化酶處理對海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響。

1.4.2 納濾膜過濾工藝

糖化結(jié)束后升溫終止酶解反應(yīng)；經(jīng)過0.2 μm孔徑的陶瓷膜組件和超濾膜組件進行過濾,去除大分子蛋白、可溶性蛋白和大分子多聚糖,獲得海藻糖粗糖液；海藻糖粗糖液經(jīng)過離子交換、活性炭進行脫色,去除色素。經(jīng)預(yù)處理后的海藻糖粗糖液在料液泵的動力下,將料液罐中的海藻糖粗糖液連續(xù)的送入納濾膜,以膜內(nèi)和膜外壓力差為推動力,葡萄糖不斷從透過液中排出,海藻糖經(jīng)循環(huán)進入料液罐中。納濾膜分離海藻糖工藝流程如圖1所示。

圖1 納濾膜分離海藻糖工藝流程圖

1.4.2.1 濃縮體積和加水體積對海藻糖分離影響

利用復(fù)合卷式納濾膜MWCO 250.00在卷式膜多功能過濾設(shè)備中進行過濾,控制過濾壓力為20 bar,流速為5.5 L/min,過濾液溫度為30 ℃,分別探究濃縮倍數(shù)(1～3倍)和加水體積(1～5倍)對平均膜通量、海藻糖回收率和海藻糖純度的影響。

1.4.2.2 操作方式對膜分離性質(zhì)影響

由于間歇式過濾存在操作困難、控制精確度低、操作可重復(fù)性和連續(xù)性差等問題。因此,在上述優(yōu)化濃縮體積和加水量的基礎(chǔ)上,利用連續(xù)式過濾代替間歇式過濾方式,探究連續(xù)式過濾的操作方式對海藻糖分離過程中的操作時間、海藻糖回收率、海藻糖純度的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙酶法轉(zhuǎn)化制備海藻糖

2.1.1 普魯蘭酶添加量對海藻糖轉(zhuǎn)化影響

MTSase和MTHase只能作用于直鏈麥芽糊精,然而淀粉中含有較多的支鏈淀粉,由于支鏈淀粉不能被利用,導(dǎo)致麥芽糊精的利用率降低。因此,在轉(zhuǎn)化過程中添加普魯蘭酶,通過水麥芽糊精中的α-1,6-糖苷鍵,將含有支鏈的麥芽糊精水解,轉(zhuǎn)化成為只含有 α-1,4-糖苷鍵的直鏈糊精,從而提高底物利用效率。如圖2所示,不添加普魯蘭酶時海藻糖轉(zhuǎn)化率為47.8%,添加普魯蘭酶后海藻糖轉(zhuǎn)化率提高到55.6%。因此,普魯蘭酶的添加有效提高了底物的利用效率；但隨著普魯蘭酶量的增加,轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定,這是由于較多的支鏈糊精被水解,普魯蘭酶的去支鏈的能力達到飽和。因此普魯蘭酶最佳添加量為5 U/g麥芽糊精。

圖2 普魯蘭酶添加對海藻糖轉(zhuǎn)化的影響

2.1.2 溫度對海藻糖轉(zhuǎn)化的影響

溫度不僅影響麥芽糊精的物理狀態(tài)和分子運動,也會影響酶學(xué)性質(zhì)[15]。在上述優(yōu)化結(jié)果基礎(chǔ)上,探究不同溫度對海藻糖轉(zhuǎn)化的影響。如圖3所示,當(dāng)溫度低于60 ℃時,海藻糖轉(zhuǎn)化率隨溫度升高而逐漸增加；60 ℃時,海藻糖轉(zhuǎn)化率最大為60.2%；當(dāng)溫度繼續(xù)升高時,海藻糖轉(zhuǎn)化率逐漸下降,這是由于隨著溫度的升高,酶的穩(wěn)定性降低導(dǎo)致酶活損失,使轉(zhuǎn)化率下降。因此海藻糖最適轉(zhuǎn)化溫度為60 ℃。

圖3 溫度對海藻糖轉(zhuǎn)化的影響

2.1.3 pH對海藻糖轉(zhuǎn)化的影響

pH影響酶的酶活和底物的解離狀態(tài),進而影響催化效率[16]。因此在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,探究不同pH對海藻糖轉(zhuǎn)化的影響。如圖4所示,當(dāng)pH低于6.0時,海藻糖轉(zhuǎn)化率隨pH增加而升高,pH為6.0時轉(zhuǎn)化率最大為62.7%；當(dāng)pH繼續(xù)增加時轉(zhuǎn)化率逐漸下降。因此海藻糖最佳轉(zhuǎn)化pH為6.0。

圖4 pH對海藻糖轉(zhuǎn)化的影響

2.1.4 MTSase和MTHase添加量對海藻糖轉(zhuǎn)化的影響

酶量添加是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一,特別是在協(xié)同催化的多酶反應(yīng)中具有重要的影響。酶的添加比例不僅影響轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的成分,同時加酶量也決定生產(chǎn)成本。在上述研究的基礎(chǔ)上,探究MTSase和MTHase不同添加比例對海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響。如圖5所示,隨著MTHase添加量逐漸增加,海藻糖轉(zhuǎn)化率逐漸提高；當(dāng)MTHase添加量為95 U/g時,海藻糖轉(zhuǎn)化率相對較高；當(dāng)MTHase添加量高于35 U/g時,由于MTSase水解麥芽糊精底物能力逐漸增加,造成海藻糖轉(zhuǎn)化率降低；當(dāng)MTSase和MTHase添加量分別為95 U/g麥芽糊精和35 U/g麥芽糊精時達到最大轉(zhuǎn)化率為72.4%。

圖5 MTSase和MTHase添加量對海藻糖轉(zhuǎn)化影響

2.1.5 轉(zhuǎn)化時間對海藻糖轉(zhuǎn)化率影響

轉(zhuǎn)化時間決定轉(zhuǎn)化周期,影響設(shè)備的利用率,因此需要控制最佳轉(zhuǎn)化時間。在上述研究的基礎(chǔ)上,探究轉(zhuǎn)化時間對海藻糖轉(zhuǎn)化的影響。如圖6所示,在16 h之前,海藻糖轉(zhuǎn)化率迅速增加。16～48 h時轉(zhuǎn)化率緩慢增加；48 h后轉(zhuǎn)化率趨于平穩(wěn)。因此,在保證最大轉(zhuǎn)化率的基礎(chǔ)上,確定轉(zhuǎn)化時間為48 h。

圖6 轉(zhuǎn)化時間對海藻糖轉(zhuǎn)化率影響

2.1.6 糖化酶的添加對海藻糖粗糖液成分影響

在海藻糖轉(zhuǎn)化結(jié)束后,海藻糖轉(zhuǎn)化液中除了含有大量海藻糖外,還含有少量的麥芽糖和麥芽寡糖等。為了制備獲得高純度的海藻糖,在海藻糖轉(zhuǎn)化結(jié)束后,向海藻糖轉(zhuǎn)化液中添加糖化酶,將海藻糖粗糖液中的麥芽糖、麥芽寡糖等水解為葡萄糖,便于后續(xù)的分離純化。在上述研究的基礎(chǔ)上,探究糖化酶的添加對海藻糖粗糖液成分的影響。如圖7所示,經(jīng)糖化處理后,海藻糖糖液中的麥芽糖和麥芽寡糖分別由7.7%和3.1%降低到0.5%和0.3%,并且研究發(fā)現(xiàn)海藻糖的濃度增加了2.3%,海藻糖最終轉(zhuǎn)化率為74.7%。

圖7 糖化酶的添加對海藻糖粗糖液成分影響

2.2 濃縮體積和加水倍數(shù)對海藻糖分離的影響

將轉(zhuǎn)化、糖化、微濾、超濾、脫色后的海藻糖粗糖液進行納濾分離,控制納濾壓力為20 bar,流速為5.5 L/min,過濾液溫度為30 ℃,探究復(fù)合卷式納濾膜對海藻糖分離的影響。其中圖8為不同濃縮倍數(shù)和加水倍數(shù)對膜通量的影響；圖9為不同濃縮倍數(shù)和加水倍數(shù)對海藻糖回收率的影響；圖10為不同濃縮倍數(shù)和加水倍數(shù)對海藻糖純度的影響。

圖8 濃縮倍數(shù)和加水倍數(shù)對膜通量影響

圖9 濃縮倍數(shù)和加水倍數(shù)對海藻糖回收率影響

圖10 濃縮倍數(shù)和加水倍數(shù)對海藻糖純度影響

當(dāng)濃縮倍數(shù)相同時,加入水倍數(shù)越多,膜的平均通量越大,海藻糖的純度越高,但回收率逐漸減少,這是由于加水倍數(shù)的增加使得納濾時間變長,造成海藻糖損失增加；當(dāng)加水倍數(shù)一定時,隨著濃縮倍數(shù)的增加,平均通量和海藻糖的回收率逐漸降低,海藻糖的純度緩慢增加,隨著濃縮倍數(shù)的增加料液變得粘稠,膜通量急劇降低,這種狀態(tài)不利于海藻糖的分離。綜合考慮平均膜通量、海藻糖回收率、海藻糖純度等因素,當(dāng)海藻糖濃縮倍數(shù)為2,加水倍數(shù)為原倍數(shù)的5倍時,平均膜通量為9.64 L·(m2·h),海藻糖回收率為87.8%,海藻糖糖液純度為93.1%,該條件下的平均膜通量、海藻糖回收率、海藻糖純度以及用水量最佳。

2.3 操作方式對膜分離性質(zhì)的影響

間歇過濾操作工藝繁瑣,過濾過程容易造成膜通量的波動。因此,為簡化操作工藝,選擇操作便捷的連續(xù)式過濾進行海藻糖的分離。在海藻糖濃縮倍數(shù)為2,加水量為原倍數(shù)的5倍時,探究間歇式和連續(xù)式過濾的效率。如圖11所示,當(dāng)濃縮倍數(shù)相同時,連續(xù)式過濾操作的時間、海藻糖回收率、海藻糖純度均優(yōu)于間歇式過濾；但隨著濃度倍數(shù)增加,過濾時間增加,海藻糖的回收率降低,因此綜合考慮操作時間、加水倍數(shù)、海藻糖回收率和海藻糖純度等因素,選用連續(xù)式操作方式更為經(jīng)濟有效。

圖11 操作方式對海藻糖分離的影響

3 結(jié) 論

通過研究發(fā)現(xiàn),以200 g/L麥芽糊精為底物,添加普魯蘭酶5 U/g、麥芽糊精、MTSase 95 U/g麥芽糊精、MTHase 35 U/g麥芽糊精,轉(zhuǎn)化溫度60 ℃,pH 6.0,轉(zhuǎn)化48 h,海藻糖轉(zhuǎn)化率由47.8%提高到72.4%。海藻糖粗糖液經(jīng)過糖化、微濾、超濾、脫色后去除蛋白、寡糖、色素等大分子物質(zhì)進行納濾分離,結(jié)果表明連續(xù)式復(fù)合卷式納濾膜分離海藻糖的最佳濃縮體積和加水倍數(shù)分別為2倍和5倍,海藻糖的回收率為87.8%和海藻糖糖液純度為93.1%。