合并與未合并糖尿病的胰腺癌患者血管生成素樣蛋白2在血清中的表達及其與預后的關系

秦 雯，陳泰文，鄭海平，黃夏寧，朱小東

1 廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院 a. 病理科； b. 腫瘤科，南寧 530199；2 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 胃及腹部腫瘤病區(qū)，南寧 530021；3 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，南寧 530021

胰腺癌是預后最差的惡性腫瘤之一，5年生存率<5%，且近年來患者數(shù)量持續(xù)增加。盡管醫(yī)療技術已取得重大進步，但胰腺癌存活期短的情況并未發(fā)生改變，這與胰腺癌難以早期診斷和缺乏有效的治療藥物有關。此外，大量研究[1-2]顯示，糖尿病與胰腺癌之間存在復雜的關系，二者互為因果：一方面，多達45%的胰腺癌病例表現(xiàn)為新發(fā)糖尿病，即胰腺癌是引發(fā)糖尿病的原因之一；另一方面，≥5年的長期2型糖尿病者發(fā)生胰腺癌的風險增加50%[3]，即長期存在的2型糖尿病是胰腺癌的危險因素。血管生成素樣蛋白2(angiopoietin-like protein 2，ANGPTL2)是血管生成素蛋白家族的成員，其本質(zhì)是一種脂肪來源的分泌糖蛋白[4]。在缺氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，脂肪組織分泌的ANGPTL2增加。ANGPTL2由493個氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)包括N端的卷曲-卷曲結(jié)構(gòu)域和C端的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域[5]。由于其在類纖維蛋白區(qū)域缺少一個半胱氨酸基序，無法與絡氨酸受體Tie1、2相結(jié)合，這一結(jié)構(gòu)特點使其功能更為廣泛。據(jù)報道[6-8]，ANGPTL2在糖尿病、代謝綜合征、炎癥性疾病和腫瘤性疾病中發(fā)揮多種重要作用。因此，筆者推測ANGPTL2水平變化可能引發(fā)糖尿病和腫瘤；若糖尿病與腫瘤疊加發(fā)生，則ANGPTL2水平變化可能更為顯著。本研究旨在從臨床角度探討ANGPTL2 在合并與未合并糖尿病的胰腺癌患者中的表達水平及其對預后的預測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月—2018年1月于廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院就診的胰腺癌患者的血清標本及臨床資料。標本為患者首次就診時檢測CEA、CA19-9剩余血清樣本，凍存于-20 ℃冰箱，以備ANGPTL2檢測。納入標準：(1)臨床病理資料及隨訪資料完整，簽署知情同意書，胰腺穿刺活組織檢查或術后病理確診為胰腺癌；(2)無嚴重的心、肝、腎功能不全。排除標準：(1)接受過抗癌治療的患者，包括手術、放化療、生物制劑、基因治療和免疫治療等；(2)合并其他惡性腫瘤患者。根據(jù)是否合并糖尿病將患者分為單純胰腺癌組和合并糖尿病胰腺癌組，另選同期健康體檢者作為正常對照組。

1.2 資料獲取 通過醫(yī)院病案信息系統(tǒng)進行檢索，收集患者一般資料、入院時常規(guī)及腫瘤相關檢驗、檢查數(shù)據(jù)。自患者出院起，每3個月電話隨訪以及信訪，如果出現(xiàn)2年或以上無法聯(lián)系者，則視為失訪。病例隨訪時間為3年，隨訪內(nèi)容包括出院后生活情況、是否死亡、死亡時間及死亡原因。如果在隨訪期間患者死于胰腺癌則患者資料為完全數(shù)據(jù)，如果至隨訪截止日期患者生存，則按截尾數(shù)據(jù)處理。

1.3 檢測方法 ELISA測定血清ANGPTL2水平(USCN生命科學股份有限公司，中國武漢)。來自每個受試者的血清和標準蛋白ANGPTL2被緩沖液稀釋，并加入預包被了ANGPTL2抗體的96孔板上。于37 °C孵育2 h時后，將每孔中的液體移除，并加入檢測試劑中的工作液A，于37 ℃孵育1 h。之后，加入檢測試劑中的工作液B，于37 ℃孵育30 min。在每步操作之間，96孔板應洗5次，每次10 min。然后，在各孔中加入底物溶液、終止液，于37 ℃避光孵育15 min。最后，在450 nm處測定各孔板的吸光度。通過稀釋標準化的重組ANGPTL2蛋白繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線和樣品3次測量的平均光密度，分別計算每孔的血清ANGPTL2濃度。

1.4 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院倫理委員會審批，批號：倫審WM-2019(100)，研究對象均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入125例胰腺癌患者，分為單純胰腺癌組64例，其中男35例，女29例，平均年齡(62.91±8.78)歲；合并糖尿病胰腺癌組61例，其中男34例，女27例，平均年齡(61.00±8.23)歲；另選正常對照組66例，其中男36例，女30例，平均年齡(63.08±8.25)歲。3組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

BMI、糖化血紅蛋白(HbA1c)在3組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。合并糖尿病胰腺癌組的C反應蛋白(CRP)、甘油三酯(TG)水平均高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，但與單純胰腺癌組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。合并糖尿病胰腺癌組的總膽固醇(TC)水平低于單純胰腺癌組和健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。

2.2 各組血清腫瘤相關指標水平比較 CEA、CA19-9、ANGPTL2水平由高至低為：合并糖尿病胰腺癌組、單純胰腺癌組、健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)(表2)。

2.3 胰腺癌患者血清ANGPTL2水平與CA19-9、CEA的相關性 125例胰腺癌患者的血清ANGPTL2為 6.56(5.58～7.89)ng/ml，CA19-9為118.43(79.76～165.32)U/ml，CEA為24.93(12.54～34.67)ng/ml。相關性分析結(jié)果顯示，胰腺癌患者血清ANGPTL2與CA19-9、CEA均呈正相關(r值分別為0.560、0.731，P值均<0.001)(圖1、2)。

圖1 胰腺癌患者血清ANGPTL2與CA19-9的相關性分析

圖2 胰腺癌患者血清ANGPTL2與CEA的相關性分析

表1 3組一般資料比較

表2 3組人群血清CEA、CA19-9及ANGPTL2水平比較

2.4 影響胰腺癌患者遠期生存的單因素和多因素分析

單因素分析顯示，腫瘤大小、遠處器官轉(zhuǎn)移、分化程度、CEA、ANGPTL2、HbA1c對胰腺癌患者遠期生存有影響(P值均<0.05)(表3)。多因素分析顯示，腫瘤大小、遠處器官轉(zhuǎn)移、分化程度、CEA和ANGPTL2是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素(P值均<0.05)(表4)。

表3 影響胰腺癌患者遠期生存的單因素分析

表4 影響胰腺癌患者遠期生存的多因素分析

2.5 血清ANGPTL2表達水平、是否合并糖尿病與胰腺癌患者預后的關系 以胰腺癌患者ANGPTL2的平均值為界將其分為ANGPTL2高表達組和ANGPTL2低表達組。由于HbA1c常規(guī)參考值為(4～6)%，故本研究將HbA1c值>6%的胰腺癌患者作為合并糖尿病胰腺癌組，而HbA1c值≤6%的胰腺癌患者作為單純胰腺癌組。結(jié)果顯示，ANGPTL2高表達組的2年生存率明顯低于ANGPTL2低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(8.51% vs 25.81%，χ2=5.651，P=0.017)(圖3)。合并糖尿病胰腺癌組與單純胰腺癌組相比，2年生存率差異無統(tǒng)計學意義(8.20% vs 12.50%，χ2=0.621，P=0.431)(表5，圖4)。

表5 血清ANGPTL2表達水平、是否合并糖尿病 與胰腺癌患者預后的關系

圖3 ANGPTL2高/低表達組胰腺癌患者的生存曲線

圖4 單純胰腺癌組與合并糖尿病胰腺癌組患者的生存曲線

2.6 血清ANGPTL2表達水平與合并糖尿病的胰腺癌患者預后的關系 在合并糖尿病的胰腺癌患者中，ANGPTL2高表達組的2年生存率明顯低于ANGPTL2低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(2.20% vs 32.70 %，χ2=24.895，P<0.001)。

3 討論

文獻[9]報道，惡性腫瘤獨特的能量獲取途徑——糖酵解往往能使惡性腫瘤患者快速消耗脂肪和蛋白質(zhì)，從而處于代謝異常狀態(tài)；反之，不同程度的代謝異常也常常在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，其中包括血糖異常。由于胰腺癌所處部位的特殊性，使得其與血糖的關系更為密切：一方面，腫瘤組織對胰島的破壞和胰管的阻塞可能導致糖尿病的發(fā)生；另一方面，糖尿病可能通過多種機制促進胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。ANGPTL2是近年來關注度較高的生物分子。有趣的是，研究報道認為ANGPTL2可能引起胰腺癌[10]或糖尿病[11]，而胰腺癌與糖尿病又互為因果[12-14]。據(jù)此筆者從臨床角度探討胰腺癌患者在合并與未合并糖尿病時其血清ANGPTL2的表達情況，進而探討ANGPTL2的表達與胰腺癌患者，特別是合并糖尿病的胰腺癌患者預后的關系。

ANGPTL2在正常生理條件下主要分布于人類的心臟、胃、脾臟和小腸等部位，少量分布于卵巢、胰腺和胸腺組織中[5,15]。ANGPTL2可以由多種不同細胞分泌，如脂肪細胞[15]、內(nèi)皮細胞[16]、巨噬細胞[17]、角質(zhì)形成細胞[18]和癌細胞[19]，因此具備促進血管生成、炎癥和癌癥發(fā)生等多種重要生理和病理功能。已有文獻報道ANGPTL2是一種促癌因子，在多種類型的惡性腫瘤患者中呈高表達，包括肺癌[20-21]、骨肉瘤[7]、甲狀腺癌[22]、結(jié)腸癌[8]、胃癌[23]、白血病[24]等。胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一，其預后不良與早期轉(zhuǎn)移行為、侵襲性臨床過程和化療效果有限有關。研究[25]表明，ANGPTL2也可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關：ANGPTL2在胰腺癌細胞中過度表達可導致腫瘤細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。另有研究[26]表明，ANGPTL2及其受體LILRB2之間的自分泌信號傳導能夠誘導前胰腺導管細胞模型的腫瘤進展。但是，這些基礎研究結(jié)果尚待進一步的臨床證實。

本研究結(jié)果顯示，合并糖尿病胰腺癌組患者血清ANGPTL2水平明顯高于單純胰腺癌組，而后者ANGPTL2水平明顯高于健康對照組，提示合并糖尿病的胰腺癌患者由于糖尿病和胰腺癌的雙重疊加作用，其血清ANGPTL2水平可能成為比胰腺癌常用腫瘤檢測指標(CA19-9、CEA)更敏感的早期診斷或預后指標。3組血清ANGPTL2與CEA、CA19-9的水平變化趨勢相一致；進一步相關分析證實，血清ANGPTL2水平與CEA、CA19-9呈正相關，表明在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能存在某些相互關聯(lián)的機制將三者聯(lián)系起來[27]。單因素分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小、遠處器官轉(zhuǎn)移、分化程度、CEA、ANGPTL2、HbA1c與胰腺癌患者遠期生存密切相關，其中腫瘤大小、遠處器官轉(zhuǎn)移、分化程度、CEA和ANGPTL2是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素。隨后，對生存率采用log-rank檢驗，結(jié)果顯示，在所有胰腺癌患者中ANGPTL2高表達組的2年生存率明顯低于ANGPTL2低表達組，在合并糖尿病的胰腺癌患者中ANGPTL2高表達組的2年生存率也明顯低于ANGPTL2低表達組；而血糖升高組胰腺癌患者與糖正常組胰腺癌患者相比，2年生存率差異無統(tǒng)計學意義。這可能與時間截點的選取和樣本量有關，也可能與本研究的局限性有關，例如本研究的一般檢驗數(shù)據(jù)涉及3家醫(yī)院的檢驗科，可能存在檢測指標的室間差異。

綜上所述，本研究結(jié)果提示ANGPTL2具有評估胰腺患者預后的潛力，并且在合并糖尿病的胰腺癌患者中其升高幅度更大；又由于血清ANGPTL2檢測具有簡便、可重復的優(yōu)勢，ANGPTL2可能成為評價胰腺癌患者，特別是合并糖尿病的胰腺癌患者預后的有效指標。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：秦雯負責課題設計，資料分析，撰寫論文；陳泰文、鄭海平參與收集數(shù)據(jù)和樣本，進行統(tǒng)計分析；黃夏寧負責血清ELISA測定血清ANGPTL2濃度的實驗操作及統(tǒng)計學分析；朱小東指導撰寫文章并最后定稿。