細(xì)胞自噬及其在肝纖維化中的作用

代倩蘭，劉紹能

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100053

自噬是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，也是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。越來(lái)越多的研究證明自噬與肝纖維化關(guān)系密切，在活化肝星狀細(xì)胞(HSC)、保護(hù)肝細(xì)胞、穩(wěn)定肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)等過程中發(fā)揮著重要的作用。肝纖維化是慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，是由于肌成纖維細(xì)胞(myo-fibroblasts,MF)產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)不斷積累引起的[1-2]。MF是各種慢性肝損傷過程中產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞，而HSC是MF的主要來(lái)源[3], 所以HSC的活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。此外，免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、信號(hào)通路等也是影響肝纖維化的重要因素。在這個(gè)過程中，自噬也起著重要的作用，本文對(duì)自噬的過程、功能及其在肝纖維化中的作用作一綜述。

1 自噬的發(fā)生過程

自噬是指真核細(xì)胞內(nèi)溶酶體參與長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)、受損細(xì)胞器以及入侵微生物的降解來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過程[4-5]。在1962年，Ashford和Porter就提出細(xì)胞中存在“self-eating(自食)”現(xiàn)象[6]，比利時(shí)細(xì)胞學(xué)家Christiande Duve和Robert Wattiaeux引入“autophagy(自噬)”的概念用以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外物質(zhì)的降解[7]，至20世紀(jì)80年代日本科學(xué)家Yoshinori Ohsumi通過研究酵母細(xì)胞自噬得出自噬的部分機(jī)制。近年來(lái)，自噬的機(jī)制及自噬在各種疾病中的作用研究取得了一定的進(jìn)展，但仍不明晰。

自噬發(fā)生的整個(gè)過程由自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes，Atg)及其編碼的Atg蛋白分子家族所介導(dǎo)，包括 LC3、Beclin1、PI3K等30多個(gè)基因[8]。自噬的過程可分為4個(gè)步驟：(1)自噬的誘發(fā)。細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)、能量供應(yīng)以及氮或氨基酸合成受限時(shí)，主要通過雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)與ULK1復(fù)合物之間產(chǎn)生相互作用，進(jìn)而通過自噬基因組裝形成前自噬體。(2)自噬體形成。隔膜延伸并包裹部分細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，具體過程主要包括兩條泛素化途徑Atg5-Atg12-Atg16和 LC3-II的修飾過程。(3)自噬體運(yùn)輸、融合。自噬體經(jīng)誘導(dǎo)到達(dá)溶酶體，自噬體外膜融合溶酶體膜，而內(nèi)膜和自噬體的內(nèi)部物質(zhì)則進(jìn)入溶酶體內(nèi)，構(gòu)成了可以在電鏡下觀察到的自噬溶酶體。(4)自噬體和內(nèi)部物質(zhì)的降解、重利用。在自噬溶酶體內(nèi)，自噬體膜和內(nèi)容物被降解，產(chǎn)生的大分子物質(zhì)通過通透酶Atg22被回收到細(xì)胞質(zhì)中以供利用[9]。

哺乳動(dòng)物的細(xì)胞自噬，根據(jù)底物被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)的方式不同可分為三類。(1)巨自噬：由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)源的膜包繞待降解物形成自噬體，然后與溶酶體融合并降解其內(nèi)容物，目前的研究大多聚集在巨自噬，通常所說的自噬即巨自噬；(2)微自噬：溶酶體膜直接包裹受損細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等，并將其降解；(3)分子伴侶介導(dǎo)的自噬：胞質(zhì)內(nèi)的蛋白被分子伴侶識(shí)別并結(jié)合后共同轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化并降解[10-12]。根據(jù)自噬對(duì)降解底物的選擇性將自噬分為非選擇性自噬和選擇性自噬：前者指細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器或其他胞質(zhì)成分隨機(jī)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w降解；后者指自噬對(duì)降解底物具有專一性。而選擇性自噬根據(jù)對(duì)底物選擇性的不同又分為：線粒體自噬、過氧化物酶體自噬、脂噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬等[4,13]。

2 自噬的生物學(xué)功能

從細(xì)胞水平講，自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一條必不可少的代謝途徑，是一種自我保護(hù)機(jī)制。細(xì)胞在正常生長(zhǎng)條件下能進(jìn)行較低水平的基礎(chǔ)自噬，但是當(dāng)受到一些刺激時(shí)會(huì)迅速上調(diào)[14]。自噬能夠消耗自身成分產(chǎn)生脂肪酸、氨基酸、核苷酸等，為處于饑餓狀態(tài)的細(xì)胞提供維持自身功能的能量；能夠處理過?；驌p傷的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和蛋白聚集物，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；也能夠清除入侵的微生物，保護(hù)細(xì)胞。但自噬過度活躍或者功能低下，能引起自噬應(yīng)激，損傷細(xì)胞器，甚至促進(jìn)細(xì)胞的死亡。從生物水平講，自噬對(duì)生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育起重要作用，自噬可以通過特異的降解某些蛋白或細(xì)胞因子來(lái)改變細(xì)胞的組成，決定細(xì)胞分化、發(fā)育的方向等[14]。此外，自噬參與多種疾病的致病過程，自噬或調(diào)節(jié)自噬的環(huán)節(jié)異常都可導(dǎo)致疾病發(fā)生。大量研究[15-16]證明自噬與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、肺部疾病等密切相關(guān)，可以利用誘導(dǎo)或抑制自噬來(lái)對(duì)抗疾病。

自噬在維持肝臟動(dòng)態(tài)平衡和調(diào)節(jié)肝臟功能中起著重要作用。肝臟富含溶酶體，并具有高水平的代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬[17]。肝臟是葡萄糖、脂質(zhì)代謝，解毒以及激素、膽汁酸合成的重要器官，葡萄糖和脂質(zhì)與選擇性自噬密切相關(guān)，病毒感染與復(fù)制也受自噬的影響。眾多研究發(fā)現(xiàn)自噬在脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝硬化等慢性肝病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而肝纖維化作為慢性肝病的修復(fù)反應(yīng)更是受自噬的調(diào)節(jié)和影響。

3 自噬與肝纖維化

3.1 自噬促進(jìn)HSC活化 HSC也叫貯脂細(xì)胞，其胞內(nèi)含有大量的脂滴，是生成MF的主要細(xì)胞群。正常情況下處于靜息狀態(tài)的HSC位于肝臟竇周Disse腔內(nèi)，當(dāng)肝臟受損傷時(shí)，各種因素的刺激導(dǎo)致靜息狀態(tài)下的HSC激活成為具有增殖性、收縮性、成纖維性的MF[18]，形態(tài)變得大而扁平，脂質(zhì)減少，轉(zhuǎn)而向組織受損部位遷移并積累，分泌多種促炎因子、促纖維化因子，并通過旁分泌和自分泌作用，進(jìn)一步刺激未激活轉(zhuǎn)化的HSC轉(zhuǎn)變?yōu)镸F。其最突出的特征是胞質(zhì)脂滴的消失和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)增加[19-20]。HSC的活化與其自噬密切相關(guān)，尤其是脂噬[21-22]。

研究[23]發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，自噬相關(guān)基因LC3B在肝組織中表達(dá)明顯增加，在原代培養(yǎng)的、活化的HSC中得到相同的結(jié)果，從乙型肝炎纖維化肝組織中分離出的HSC亦發(fā)現(xiàn)自噬活性明顯增強(qiáng)[24]，表明肝纖維化時(shí)HSC的自噬活性增強(qiáng)。也有另一個(gè)角度的研究[22]發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因Atg2A缺失的HSC在細(xì)胞培養(yǎng)中不能進(jìn)行自發(fā)的向MF轉(zhuǎn)化，自噬相關(guān)基因Atg5或Atg7在HSC特異性缺失的小鼠不容易被四氯化碳誘導(dǎo)致肝纖維化[25]，可以看出HSC的活化依賴于自噬。這主要是由于自噬介導(dǎo)的脂質(zhì)降解[26]，即脂噬，自噬通過脂滴的動(dòng)員、游離脂肪酸的釋放和線粒體β氧化為HSC的活化提供能量,從而將HSC從靜止態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顟B(tài)[27]。研究[21,28]發(fā)現(xiàn)在體外活化培養(yǎng)小鼠的HSC過程中，自噬通量明顯增加,脂噬將脂滴分解為自由視黃酯釋放到細(xì)胞外間隙，在脂肪酶的酶解作用下形成自由脂肪酸，從而促進(jìn)線粒體內(nèi)ATP的產(chǎn)生和HSC活化；抑制其自噬則ATP的產(chǎn)生減少，從而抑制HSC活化。用四氯化碳誘導(dǎo)特異性自噬相關(guān)基因Atg5或Atg7缺失的小鼠產(chǎn)生肝纖維化，結(jié)果肝纖維化程度好轉(zhuǎn),同時(shí)HSC中脂滴的丟失減少[24]。綜上所述，HSC自噬尤其是脂噬為HSC活化供能，抑制HSC的自噬可以減輕肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

3.2 自噬保護(hù)肝細(xì)胞的作用 肝臟細(xì)胞分為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(肝細(xì)胞)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，肝細(xì)胞約占肝內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的60%，當(dāng)持續(xù)性肝損傷時(shí)通過旁分泌作用激活HSC活化，促進(jìn)纖維化進(jìn)程。在肝細(xì)胞中，自噬主要作為一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、抑制肝細(xì)胞凋亡，從而抑制肝纖維化[29]。肝細(xì)胞受到損傷時(shí)可發(fā)生選擇性自噬，降低細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷的可能性[28]，保護(hù)受損的肝細(xì)胞。在慢性乙型肝炎中，肝細(xì)胞自噬的激活能夠抑制HBV復(fù)制，同時(shí)也抑制HBV感染的肝細(xì)胞凋亡[30]；在脂肪性肝病中，肝細(xì)胞脂質(zhì)的積累可以誘導(dǎo)HSC活化而致肝纖維化[31]，而脂噬活性提高可以減少脂肪堆積；在酒精性肝病、肝毒性藥物、缺血/再灌注損傷所致的肝細(xì)胞損傷中，脂滴、錯(cuò)誤折疊的蛋白及細(xì)胞內(nèi)受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器能通過自噬的有效調(diào)節(jié)進(jìn)行分解代謝及清除，為肝細(xì)胞提供能量和物質(zhì)的需求[32-35]，均起到抑制肝細(xì)胞損傷的作用。此外，在遺傳性疾病α1抗胰蛋白酶(α1-AT)缺陷而致肝纖維化的小鼠中，用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生自噬，可發(fā)現(xiàn)肝纖維化的程度明顯減輕[36-37]。自噬主要通過保護(hù)受損細(xì)胞、抑制細(xì)胞凋亡而抑制肝纖維化。

3.3 自噬對(duì)LSEC的作用 LSEC是非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的一種，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是無(wú)隔膜的窗孔及缺如完整的基底膜，主要介導(dǎo)肝臟的過濾與清除功能，以此維持肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)出現(xiàn)慢性肝損傷時(shí)，受損的LSEC出現(xiàn)失去窗孔、形成有組織的連續(xù)基底膜和肝竇毛細(xì)血管化等改變，并通過合成TGFβ和血小板衍生生長(zhǎng)因子導(dǎo)致HSC的增殖與活化，ECM積累，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[38-39]。自噬可維持LSEC的穩(wěn)態(tài)。在體外和體內(nèi)的LSEC毛細(xì)血管化過程中自噬均會(huì)迅速上調(diào)，使用藥物或者基因下調(diào)LSEC自噬會(huì)增加氧化應(yīng)激反應(yīng)。在體內(nèi)肝損傷期間，LSEC自噬的選擇性喪失導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，肝內(nèi)NO降低，氧化應(yīng)激損傷，加重纖維化[40]。自噬有助于維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并保護(hù)LSEC在疾病的早期階段免受氧化應(yīng)激。在肝臟疾病的早期階段選擇性地在LSEC中增強(qiáng)自噬可能是改變疾病病程和防止纖維化進(jìn)展的一種可行的方法[41]。此外，也有研究[42]發(fā)現(xiàn)抑制LSEC自噬可以減輕肝纖維化，caveolin-1(Cav-1)是LSEC中與自噬相關(guān)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，Cav-1的自噬降低可以通過抑制NO依賴性途徑和F-肌動(dòng)蛋白重塑而促進(jìn)LSEC的防御,從而減輕肝纖維化。這可能與動(dòng)物模型不同以及肝纖維化的時(shí)期不同有關(guān)。

3.4 自噬與抗炎作用 肝臟巨噬細(xì)胞包括肝臟固有巨噬細(xì)胞即Kupffer細(xì)胞和肝損傷時(shí)自外周募集而來(lái)的單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞(monocyte-derived macrophages，MoMF)[43]。巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性和異質(zhì)性，會(huì)朝向不同的表型極化，分為M1型和M2型巨噬細(xì)胞，其表面標(biāo)志物以及所產(chǎn)生的細(xì)胞因子均存在多樣性。肝臟巨噬細(xì)胞合成和分泌TGFβ1等纖維化細(xì)胞因子，可以激活HSC和MF,導(dǎo)致肝纖維化[44]。肝臟巨噬細(xì)胞被廣泛認(rèn)為在炎癥中具有促纖維化作用，其中的機(jī)制可能與MoMF的聚集有關(guān)，抑制肝臟募集外周巨噬細(xì)胞，能減輕肝纖維化[45]。M1型巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子或趨化因子，能夠放大炎癥反應(yīng)并有助于成纖維細(xì)胞的增殖和招募；當(dāng)病變持續(xù)存在M2型巨噬細(xì)胞發(fā)揮重要的促分裂作用，并分泌TGFβ1、PDGF、VEGF、IL-1A、IL-1B 等激活成纖維細(xì)胞，加重肝纖維化。

巨噬細(xì)胞自噬主要通過抑制炎癥小體的激活，從而抑制分泌促炎和纖維化細(xì)胞因子的分泌，起到對(duì)肝纖維化的抑制作用[46-47]。研究[48]發(fā)現(xiàn)Atg5缺乏的小鼠更容易受四氯化碳誘導(dǎo)致肝纖維化，并且在體外研究中，Atg5缺乏的小鼠肝臟IL-1A和IL-1B水平較高，炎癥細(xì)胞募集增強(qiáng)，導(dǎo)致纖維化加重。Tao等[49]研究發(fā)現(xiàn)自噬的抑制降低了細(xì)胞質(zhì)CTSB，減輕了NLRP3炎性小體的活化，從而減弱了NaAsO誘導(dǎo)的HSC活化，提示NaAsO通過自噬-CTSB-NLRP3炎性體途徑誘導(dǎo)HSC活化。也有研究[50]發(fā)現(xiàn)，缺乏自噬的肝巨噬細(xì)胞可通過增強(qiáng)線粒體活性氧-NF-κB-IL-1α/β途徑促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。

此外，自噬還能通過調(diào)控T淋巴細(xì)胞的活化抑制炎癥反應(yīng)，主要通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的炎癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。自噬缺陷的巨噬細(xì)胞能過度分泌IL-1α和 IL-1β，這兩種胞因子與IL-6和TGFβ一起促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化并分泌IL-17[51]，對(duì)樹突狀細(xì)胞自噬的抑制也增強(qiáng)了T淋巴細(xì)胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，包括IL-17分泌升高所誘發(fā)的系列免疫反應(yīng)[52]。

3.5 自噬參與信號(hào)傳導(dǎo) 近年來(lái)，自噬與信號(hào)通路的研究日益增多。甲基腺嘌呤(3-MA)是一種選擇性的Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制劑，能阻斷自噬體的形成，Cassidy等[53]研究發(fā)現(xiàn)3-MA可抑制HSC自噬標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB在體內(nèi)的表達(dá)，減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化。氧化應(yīng)激可以促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[54]，而Nrf2-keap1-ARE是主要的抗氧化應(yīng)激軸，王瑩等[55]研究發(fā)現(xiàn)LC3Ⅱ可介導(dǎo)自噬底物p62蛋白消耗，繼而抑制Nrf2抗氧化應(yīng)激通路，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。此外TGFβ1/Smads通路、mTOR/STAT3通路等都參與自噬的調(diào)節(jié)從而影響肝纖維化[56-59]。最近研究[60]發(fā)現(xiàn)，HSC自噬可以通過減少細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)的釋放而減輕肝纖維化。在肝臟中，受損肝細(xì)胞和LSEC產(chǎn)生的EV可誘導(dǎo)HSC的活化和遷移，進(jìn)而參與肝纖維化的進(jìn)程。

4 結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞自噬在肝纖維化過程中的作用是復(fù)雜的，并且具有雙向性。從目前的研究來(lái)看，自噬上調(diào)加重肝纖維化的作用主要是在HSC自噬中促進(jìn)HSC活化，尤其是脂噬可以為其活化提供能量。而自噬上調(diào)對(duì)肝纖維化的抑制作用則主要體現(xiàn)在肝細(xì)胞以及LSEC自噬的保護(hù)作用和免疫細(xì)胞自噬增強(qiáng)抗炎作用中。此外，多種信號(hào)通路研究提示，HSC自噬上調(diào)加重肝纖維化，而在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，HSC自噬上調(diào)可減少EV釋放，從而抑制肝纖維化。不同種類細(xì)胞的自噬以及不同底物不同水平的細(xì)胞自噬可能對(duì)肝纖維化的作用機(jī)制有所偏重或不同。此外，其復(fù)雜性也許與疾病的種類和纖維化的時(shí)期有關(guān)。在以后的研究中，應(yīng)該限定更多條件，更加細(xì)化的研究自噬在不同細(xì)胞、不同階段肝纖維化中的機(jī)制和作用，找到更確定和可靠的機(jī)制和靶點(diǎn)，進(jìn)而為選擇性的干預(yù)肝細(xì)胞自噬、治療肝纖維化提供新途徑。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：代倩蘭負(fù)責(zé)查找文獻(xiàn)，資料分析，撰寫論文；劉紹能負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。