miR-203a-3p靶向JDP2基因調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移

王一祺 修文超 徐明

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)肛腸科，山東 青島 266002)

結(jié)腸癌是發(fā)病率和死亡率均較高的常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程受多基因、多階段的復(fù)雜調(diào)控，所以從分子層面精準(zhǔn)靶向醫(yī)療可有效提高結(jié)腸癌的療效，對(duì)其預(yù)防和早期診斷也具有重要意義〔1〕。miRNA是一類(lèi)非編碼小分子單鏈RNA，研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在結(jié)腸癌患者中表達(dá)失衡，參與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程，是結(jié)腸癌早期診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在分子生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)〔2〕。miR-203a-3p通過(guò)抑制鼻咽癌中的LIM和SH3結(jié)構(gòu)域蛋白(LASP)1抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔3〕；miR-203a-3p可通過(guò)下調(diào)靶基因蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)5的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖〔4〕；lncRNA HOTAIR通過(guò)上調(diào)miR-203a-3p的表達(dá)水平和Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)信號(hào)通路的活性來(lái)抑制結(jié)腸癌增殖，降低化學(xué)耐藥性〔5〕。Jun二聚化蛋白(JDP)2是一種參與組蛋白乙酰化的轉(zhuǎn)錄因子，其通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)而在細(xì)胞的生理或病理活動(dòng)中發(fā)揮功能作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)JDP2是一種新的抑癌因子，通過(guò)多種途徑抑制惡性腫瘤的早期侵襲和轉(zhuǎn)移，JDP2可通過(guò)不同通路抑制人胰腺癌上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔7〕。但miR-203a-3p調(diào)控JDP2基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響還未有報(bào)道，本研究探討miR-203a-3p調(diào)控JDP2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1材料 結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、SW620、LOVO、HT29和人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)自Sigma公司；Matrigel膠、Transwell小室購(gòu)于美國(guó)BD公司；放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗兔IgG二抗、兔源β-actin、JDP2、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK)1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) SW480、SW620、LOVO、HT29和NCM460細(xì)胞均采用Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)孵育，培養(yǎng)箱設(shè)置為37 ℃、含5% CO2、飽和濕度。

1.3轉(zhuǎn)染與分組 將80%融合的對(duì)數(shù)期HT29細(xì)胞(接種96孔板)用無(wú)血清RPMI1640同步化12 h，隨后按照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染序列片段和質(zhì)粒的不同分為miR-203a-3p組、miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、anti-miR-203a-3p組、anti-miR-con組、pcDNA組、pcDNA-JDP2組、anti-miR-203a-3p+si-con組、anti-miR-203a-3p+si-JDP2組。

1.4qRT-PCR檢測(cè)miR-203a-3p和JDP2 mRNA表達(dá)水平 Trizol試劑提取總RNA，檢測(cè)RNA純度和濃度合格后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參按照熒光定量試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-203a-3p和JDP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5Western印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá) 在RIPA裂解液中裂解各組HT29細(xì)胞，蛋白定量后每組取50 μg蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE，利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置并轉(zhuǎn)膜，設(shè)置電流為300 mA、時(shí)間30 min。5%脫脂奶粉封閉膜后。在4℃下加入1∶1 000稀釋一抗孵育膜過(guò)夜；室溫條件下加入1∶2 000稀釋二抗孵育2 h。隨后進(jìn)行暗室顯影、定影。Quantity One軟件用于檢測(cè)蛋白條帶灰度值，JDP2、CyclinD1、CDK1、MMP-2、MMP-9蛋白與β-actin的灰度值之比即目的蛋白表達(dá)水平。

1.6MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 在96孔板培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的每孔HT29細(xì)胞中補(bǔ)充20 μl MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h后用二甲基亞砜(DMSO)溶解晶體，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)值，波長(zhǎng)為490 nm。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組的A值百分比計(jì)算細(xì)胞活性(%)。

1.7Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 調(diào)整各組HT29細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml無(wú)血清RPMI1640。取4×103個(gè)細(xì)胞加入Transwell上室(侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)包被基質(zhì)膠，遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)未包被)。取500 μl完全培養(yǎng)基加入下室。培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定穿膜HT29細(xì)胞，30 min后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下觀察、統(tǒng)計(jì)，以隨機(jī)選取5個(gè)視野的平均值表示侵襲或遷移細(xì)胞數(shù)。

1.8熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè) miR-203a-3p 對(duì)JDP2的靶向調(diào)控構(gòu)建含miR-203a-3p結(jié)合位點(diǎn)的JDP2野生型(WT)或突變型(MUT)3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(JDP2-WT和JDP2-MUT)，用LipofectamineTM2000將JDP2-WT和JDP2-MUT分別與miR-con、miR-203a-3p共轉(zhuǎn)染。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)儀測(cè)定轉(zhuǎn)染48 h各組HT29細(xì)胞熒光素酶活性和Renilla活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以二者的比值表示。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-203a-3p和JDP2在人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株與結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá) SW480、SW620、LOVO、HT29細(xì)胞中miR-203a-3p的表達(dá)較NCM460細(xì)胞顯著增加，JDP2 mRNA和JDP2蛋白表達(dá)較NCM460細(xì)胞顯著減少(均P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-203a-3p高表達(dá)，JDP2低表達(dá)；選擇表達(dá)差異最顯著的HT29細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 miR-203a-3p和JDP2在NCM460、SW480、SW620、LOVO、HT29細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 各組JDP2蛋白表達(dá)

2.2干擾miR-203a-3p對(duì)HT29細(xì)胞增殖影響 與anti-miR-con組相比，anti-miR-203a-3p組HT29細(xì)胞中miR-203a-3p的表達(dá)水平、細(xì)胞活性、CDK1和CyclinD1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)圖2和表2。

圖2 檢測(cè)HT29細(xì)胞中CDK1和CyclinD1的表達(dá)

表2 干擾miR-203a-3p表達(dá)對(duì)HT29細(xì)胞增殖的影響

2.3干擾miR-203a-3p對(duì)HT29細(xì)胞遷移侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 anti-miR-203a-3p組HT29細(xì)胞的遷移及侵襲數(shù)量較anti-miR-con組顯著降低約65.02%和63.35%(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平較anti-miR-con組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖3、4。

表3 干擾 miR-203a-3p對(duì)HT29細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 兩組HT29細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

1～2：anti miR-con組，anti-miR-203a-3p組圖4 兩組MMP-2和MMP-9的表達(dá)

2.4miR-203a-3p對(duì)JDP2的靶向作用軟件TargetScan對(duì)miR-203a-3p與JDP2之間的靶向結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖5。結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的熒光素酶活性在miR-203a-3p組與JDP2-WT載體共轉(zhuǎn)染后顯著低于miR-con組(P<0.05)；而其在miR-203a-3p組與JDP2-MUT載體共轉(zhuǎn)染后無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表4。miR-203a-3p組結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中JDP2的表達(dá)水平(0.11±0.02)較miR-con組(0.24±0.06)顯著降低；anti-miR-203a-3p組結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中JDP2的表達(dá)水平(0.63±0.05)較anti-miR-con組(0.26±0.04)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖5 JDP2的3'UTR中含有與miR-203a-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-con組,miR-203a-3p組,anti-miR-con組,anti-miR-203a-3p組圖6 結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中JDP2的表達(dá)

2.5過(guò)表達(dá)JDP2抑制HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 與pcDNA組相比，pcDNA-JDP2組HT29細(xì)胞活性、細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量均顯著降低(均P<0.05)，JDP2的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖7、表5。

2.6沉默JDP2表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-203a-3p對(duì)HT29細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 與anti-miR-203a-3p+si-con組相比，anti-miR-203a-3p+si-JDP2組HT29細(xì)胞活性顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)，JDP2的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表6、7，圖8。

1～2：pcDNA組,pcDNA-JDP2組圖7 各組HT29細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 過(guò)表達(dá)JDP2表達(dá)對(duì)HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及HT29細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和遷移相關(guān)蛋白的作用

表6 anti-miR-203a-3p和JDP2表達(dá)對(duì)HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

表7 anti-miR-203a-3p和JDP2表達(dá)對(duì)HT29細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和遷移相關(guān)蛋白的作用

1～4：anti-miR-con組,anti-miR-203a-3p組,anti-miR-203a-3p+si-con組,anti-miR-203a-3p+si-JDP2組圖8 各組檢測(cè)HT29細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和遷移相關(guān)蛋白

3 討 論

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤的原位浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移扮演重要角色〔8〕，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA可參與調(diào)控EMT的過(guò)程，進(jìn)而影響腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-203a通過(guò)負(fù)向靶向同源異形盒基因家族成員(HOX)D3和抑制通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)途徑的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成〔10〕；肝細(xì)胞外泌體miR-203a-3p可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞間充質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化〔11〕。過(guò)表達(dá)miR-203可降低結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力〔12〕；此外，miR-203可能通過(guò)調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基(P110α)、蛋白激酶B(AKT)1、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)2基因的表達(dá)調(diào)節(jié)結(jié)腸癌癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔13〕。與鄰近的正常組織相比，miR-203a-3p在結(jié)腸癌組織中上調(diào)表達(dá)，通過(guò)靶向磷酸二酯酶(PDE)4D促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖和遷移〔14〕。本研究提示miR-203a-3p在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高，干擾miR-203a-3p表達(dá)可降低HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力；下調(diào)CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平且miR-203a-3p可靶向調(diào)控JDP2的表達(dá)。

JDP2是轉(zhuǎn)錄因子的活化蛋白(AP)-1家族的成員，也是AP-1的抑制劑；JDP2過(guò)表達(dá)抑制AP-1信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)心肌細(xì)胞免于肥大和凋亡誘導(dǎo)〔15〕；JDP2缺乏會(huì)促進(jìn)心臟肥大和對(duì)壓力超負(fù)荷的功能障礙〔16〕。JDP2的高表達(dá)與肝癌患者的生存率相關(guān)，可作為肝癌的腫瘤抑制劑〔17〕；miR-501通過(guò)靶向JDP2促進(jìn)肝細(xì)胞癌的EMT〔18〕。而JDP2過(guò)表達(dá)可引起小鼠心臟功能障礙〔19〕；JDP2通過(guò)p16Ink4a-pRb和Arf-p53途徑控制缺氧誘導(dǎo)的復(fù)制衰老〔20〕。而且JDP2還能促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化，此過(guò)程中CyclinD1表達(dá)水平降低〔21〕。本研究提示JDP2在結(jié)腸癌細(xì)胞中的水平減少，過(guò)表達(dá)JDP2可下調(diào)CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)，并降低HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力且干擾miR-203a-3p抑制HT29細(xì)胞生物學(xué)行為的結(jié)果被沉默JDP2表達(dá)所逆轉(zhuǎn)。

綜上，干擾miR-203a-3p可通過(guò)上調(diào)JDP2的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，miR-203a-3p/JDP2途徑可能是結(jié)腸癌的預(yù)防、早期診斷、治療和預(yù)后預(yù)測(cè)的新靶點(diǎn)。