GW9662對內(nèi)臟脂肪素誘導的THP-1源性泡沫細胞的作用

莊世虹 成蓓

(1南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院 南京市第一醫(yī)院老年醫(yī)學科，江蘇 南京 210006；2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院老年醫(yī)學科)

在動脈粥樣硬化(AS)形成的過程中，過氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)γ在糖脂代謝平衡中的作用越來越受到重視，它與代謝綜合征的胰島素抵抗、高血壓、肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。PPARγ作為一種重要的核受體，其被證實能在巨噬細胞核內(nèi)表達，并能通過調(diào)控膽固醇代謝的關(guān)鍵酶來保持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)〔1〕。Dahl等〔2〕發(fā)現(xiàn)內(nèi)脂素(visfatin)在AS斑塊巨噬細胞中表達明顯增加，冠心病患者中其表達水平明顯升高。visfatin有促進巨噬細胞源性泡沫細胞形成的作用，本研究運用PPARγ拮抗劑GW9662進一步確證PPARγ信號通路對visfatin調(diào)控的巨噬細胞泡沫化的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人單核細胞(THP-1)購自武漢大學生物研究所，RPMI1640干粉培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，GW9662購自瑞士Alexis公司，佛波酯、TritonX-100購自美國Sigma公司，人重組visfatin購自美國Peprotech公司，蛋白提取試劑盒購自上海Beyotime公司，總膽固醇(TC)測定試劑盒購自北京五洲元業(yè)生物公司，游離膽固醇(FC)測定試劑盒購自美國Cayman公司，麗春紅染液、異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記的熒光試劑盒和異硫氰酸熒光素(FITC)標記的熒光試劑盒購自武漢博士德公司，鼠抗人腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ABC)A1和兔抗人ABCG1一抗購自英國Abcam公司，硝酸纖維素膜購自英國Whatman公司，增強型化學發(fā)光(ECL)液發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠和羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司，兔抗人β-actin一抗購自美國Cell signal公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2提取低密度脂蛋白(LDL) 取健康人血漿200 ml，用密度梯度離心法〔3〕離心后吸取離心管中間層的淡黃色脂蛋白條帶為所需的LDL，將其裝入透析袋中，置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中充分透析24 h，經(jīng)聚乙二醇濃縮，調(diào)整濃度為100 mg/L。無菌0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，4℃冰箱中避光保存，2 w內(nèi)使用。

1.3實驗分組和細胞干預 取對數(shù)生長期的THP-1加入含160 nmol/L佛波酯和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h誘導分化為巨噬細胞：細胞由懸浮狀態(tài)變?yōu)橘N壁狀態(tài)，形狀由圓形變?yōu)樗笮位虿灰?guī)則形。各組按照以下方案加入不同的干預因素：visfatin組：加入2×10-6mol/L visfatin后并加入100 mg/L LDL的培養(yǎng)液孵育處理24 h；不同濃度GW9662組：分別給予1、5、10、20 μmol/L GW9662，再加入2×10-6mol/L visfatin和100 mg/L LDL孵育24 h；LDL組：僅加入100 mg/L LDL。

1.4油紅O染色 各組細胞用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，加入油紅O染液染色10 min，再用蘇木素染液復染5 min，水洗后封片，光鏡下觀察細胞質(zhì)內(nèi)的紅色顆粒狀物質(zhì)為經(jīng)油紅O染液染色后的細胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)，細胞核為藍色。

1.5泡沫細胞計數(shù) 按Wada等〔4〕的方法進行油紅O染色后的半定量分析：將細胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)面積<細胞核面積記為“-”；細胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)面積≥細胞核面積記為“+”，即表示泡沫細胞，每一塊玻片隨機計數(shù)100個細胞。

1.6細胞內(nèi)TC和FC含量的測定 各組細胞用PBS清洗2次，刮下后離心取沉淀，用PBS清洗細胞沉淀2次，離心后棄去上清，加入7.2%三氯乙酸去蛋白，再加入等體積的氯仿和甲醇的混合溶液，冰浴中超聲破碎儀破碎細胞，離心后吸取上清，按照TC和FC測定試劑盒的使用說明分別測定細胞內(nèi)TC和FC含量，并將剩余的細胞沉淀物溶于0.1 mol/L氫氧化鈉之后，二喹啉甲酸(BCA)法測定細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量，以每毫克細胞蛋白質(zhì)中含有膽固醇的微克數(shù)(μg/mg)作為膽固醇含量的計算單位。膽固醇酯(CE)等于TC與FC之間的差值。細胞內(nèi)CE/TC比值均大于50%提示泡沫細胞形成。

1.7細胞內(nèi)免疫熒光化學的表達 各組細胞經(jīng)PBS清洗3次后加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3次，每次5 min，然后用含有0.25%TritonX-100的PBS透化20 min，再用PBS清洗3次，每次5 min，之后加入正常山羊血清封閉 30 min，甩掉溶液后，加入鼠抗人ABCA1或者兔抗人ABCG1一抗在4℃孵育過夜，PBS清洗3次，再加入TRITC或者FITC標記的二抗(1∶100稀釋)，室溫下孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min，再用免疫熒光顯微鏡觀察細胞熒光情況。ABCA1和ABCG1主要在細胞漿內(nèi)表達，通過熒光顯微鏡觀察：TRITC標記的ABCA1顯示為紅色熒光，F(xiàn)ITC標記的ABCG1顯示為綠色熒光。

1.8Western印跡法檢測ABCA1和ABCG1蛋白表達 收集不同條件處理的各組細胞，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，9%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，每孔上樣量50 μg，轉(zhuǎn)膜后取出含有目的蛋白的硝酸纖維素膜，將膜放入自制的密封袋中，加入鼠抗人ABCA1一抗(1∶200稀釋)、兔抗人ABCG1一抗(1∶200稀釋)、兔抗人β-actin一抗(1∶1 000稀釋)，置于搖床上4℃孵育過夜；漂洗后分別加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠和羊抗兔(1∶1 000稀釋)二抗，室溫孵育90 min，將膜與ECL液發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像。Quantity One軟件對ABCA1及ABCG1蛋白與β-actin蛋白的光密度比值做定量分析。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1油紅O染色結(jié)果 LDL組胞質(zhì)內(nèi)紅色脂質(zhì)很少，visfatin組細胞質(zhì)內(nèi)可見有大量紅色脂質(zhì)，不同濃度GW96625組細胞質(zhì)內(nèi)紅色脂質(zhì)的含量較visfatin組逐漸增多，并隨著GW96625濃度的增加，細胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)的含量明顯增多，見圖1。

1：visfatin組；2：1 μmol/L GW9662+visfatin組；3：5 μmol/L GW9662+visfatin組；4：10 μmol/L GW9662+visfatin組；5：20 μmol/L GW9662+visfatin組；6：LDL組，下圖同圖1 各組巨噬細胞泡沫化(油紅O染色，×400)

2.2泡沫細胞計數(shù) visfatin組與1、5、10、20 μmol/L GW9662+visfatin組及LDL組對應的油紅O染色陽性的泡沫細胞計數(shù)顯示依次為：(43.67 ±1.25)個，(49.33±2.36)個，(59.67±1.70)個，(64.67±2.05)個，(65.33±3.09)個，(5.67 ±0.47)個。LDL組油紅O染色陽性的泡沫細胞數(shù)目很少，visfatin組和不同濃度GW9662組油紅O染色陽性的泡沫細胞數(shù)目較LDL組顯著增多(P<0.05)。并且隨著GW9662濃度增加，與visfatin組比較，不同濃度GW9662組泡沫細胞數(shù)目顯著增多(P<0.05)。

2.3細胞內(nèi)CE與TC比值 LDL組細胞內(nèi)CE與TC比值低，visfatin組和不同濃度GW9662組CE/TC比值較LDL組顯著增加(P<0.05)。并且隨著GW9662濃度增加，與visfatin組比較，不同濃度GW9662組CE/TC比值顯著增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組細胞內(nèi)CE與TC比值

2.4細胞內(nèi)免疫熒光化學表達 LDL組胞質(zhì)中紅色和綠色熒光含量降低，visfatin組和不同濃度GW9662組胞質(zhì)中紅色和綠色熒光含量逐漸降低。并且隨著GW9662濃度增加，與visfatin組比較，不同濃度GW9662組胞質(zhì)中紅色和綠色熒光含量逐漸降低，見圖2。

2.5ABCA1和ABCG1 蛋白表達 visfatin組與1、5、10、20 μmol/L GW9662+visfatin組及LDL組ABCA1對應的光密度比值顯示依次為：(3.45±0.06)，(2.68±0.06)，(2.21±0.04)，(1.65±0.04)，(1.46±0.02)，(3.90±0.02)；以上各組ABCG1對應的光密度比值顯示依次為：(2.19±0.05)，(1.98±0.02)，(1.88±0.03)，(1.12±0.04)，(0.88±0.03)，(2.65±0.04)。與LDL組相比，visfatin組和不同濃度GW9662組細胞ABCA1和ABCG1蛋白表達顯著降低(P<0.05)。并且隨著GW9662濃度增加，與visfatin組比較，不同濃度GW9662組ABCA1和ABCG1 蛋白表達顯著下降(P<0.05)。見圖3。

圖2 各組免疫熒光表達(免疫熒光染色，×200)

圖3 各組ABCA1和ABCG1蛋白表達

3 討 論

visfatin稱為煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)或前B細胞集落增強因子(PBEF)，是新發(fā)現(xiàn)的一種主要由脂肪組織分泌的脂肪因子〔5〕，首次被鑒定為來自人外周血淋巴細胞cDNA文庫的PBEF，隨后發(fā)現(xiàn)其是一種多效性蛋白質(zhì)。作為一個重要的中介，脂肪組織中的巨噬細胞是visfatin主要來源〔6〕，具有至少3種已知的特定功能特性：在催化煙酰胺產(chǎn)生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的限速步驟中起酶的作用；是一種新型胰島素脂肪分泌因子；是促炎和免疫調(diào)節(jié)過程中的調(diào)節(jié)因子，其涉及許多疾病過程，包括AS。

visfatin在AS中具有促炎和促血管生成的特性，據(jù)報道在AS不穩(wěn)定斑塊處的泡沫細胞和巨噬細胞可表達這種特性〔7〕。Dahl等〔2〕發(fā)現(xiàn)AS不穩(wěn)定斑塊中巨噬細胞visfatin mRNA水平增加，表明visfatin在炎癥和斑塊不穩(wěn)定中起作用。有研究發(fā)現(xiàn)血清visfatin水平升高〔8〕與慢性血液透析患者的AS〔9〕和代謝綜合征患者頸動脈AS有關(guān)。細胞內(nèi)visfatin和PPARγ表達與人類AS具有強相關(guān)性，而與正常的動脈并無相關(guān)性〔10〕。在血管壁損傷處聚集大量可釋放的CE和FC的泡沫細胞，形成了AS斑塊脂質(zhì)核心〔11〕。visfatin具有促進細胞內(nèi)CE蓄積、抑制FC流出而導致巨噬細胞泡沫化的作用。膽固醇輸出主要由幾種細胞膜膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白介導，包括ABCA1和ABCG1。超過50%的膽固醇通過ABCA1從巨噬細胞中排出，而在晚期斑塊中，ABCA1的表達下降導致膽固醇外流減少80%。ABCA1和ABCG1的AS保護功能取決于它們動員細胞內(nèi)膽固醇的能力。ABCA1可介導膽固醇和磷脂向脂質(zhì)缺乏受體如載脂蛋白(apo)A-Ⅰ的輸出，而ABCG1可介導甾醇輸出至脂質(zhì)受體如高密度脂蛋白(HDL)。ABCA1和ABCG1一起能介導大多數(shù)細胞膽固醇輸出。肝臟X受體(LXRα)和PPARγ作為膽固醇傳感器而發(fā)揮作用，通過ABCA1、ABCG1和B類1型清道夫受體(SR-B1)刺激膽固醇從細胞外流到HDL，可以防止膽固醇過量蓄積〔12〕。

本文證實PPARγ信號通路參與了visfatin雙重調(diào)控脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的機制。visfatin作為人巨噬細胞中的PPARγ靶基因，活化PPARγ誘導人巨噬細胞中的visfatin基因和蛋白分泌〔13〕。激活PPARγ通路能減輕一系列的炎癥反應〔14〕，減少白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α的分泌〔15〕，并能增強胰島素敏感性，阻斷TNF-α激活的胰島素信號通路。PPARγ能抑制泡沫細胞的形成〔16〕，PPARγ在巨噬細胞中對visfatin的誘導有助于增強細胞內(nèi)NAD+濃度。有研究顯示在特異性敲除PPARγ的巨噬細胞中大量的炎癥基因表達會加重炎癥反應程度。PPARγ配體可促進visfatin基因表達〔14〕，visfatin下調(diào)PPARγ水平進而促使AS斑塊的形成，可能激活炎癥反應誘導泡沫細胞形成。THP-1源性巨噬細胞經(jīng)PPARγ阻斷后膽固醇流出水平進一步降低，膽固醇蓄積細胞內(nèi)誘導泡沫細胞形成。PPARγ和LXRα都是轉(zhuǎn)錄因子，可被ox-LDL激活，活化的LXRα直接增加ABCA1和ABCG1的水平，可將膽固醇泵出巨噬細胞〔17，18〕。當存在凋亡細胞時，活化的PPARγ進一步增加LXRα的表達水平并協(xié)同ABCA1和ABCG的膽固醇流出功能。激活LXRα可降低人巨噬細胞中PPARγ誘導的visfatin基因和蛋白質(zhì)分泌〔10〕。巨噬細胞中的PPARγ-LXRα-ABCA1和ABCG1途徑在調(diào)節(jié)膽固醇流出中起重要作用〔10〕。研究證明體外和體內(nèi)敲除visfatin后可激活PPARα-LXRα-ABCA1和ABCG1途徑促進膽固醇流出和巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運而發(fā)揮抗AS作用〔19〕。提示PPARγ信號通路參與了visfatin對巨噬細胞源性泡沫細胞形成。綜上，PPARγ拮抗劑GW9662能促進大量的脂質(zhì)蓄積在泡沫細胞中，使visfatin干預負荷LDL的THP-1源性巨噬細胞進一步通過下調(diào)PPARγ來減少膽固醇流出從而誘導泡沫細胞形成。