長鏈非編碼RNA UCA1通過靶向調(diào)控miR-613進(jìn)而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

陸小琴 牛司強(qiáng) 毛素芳

(1雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與檢驗學(xué)院，四川 雅安 625000；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科；3隆昌市人民醫(yī)院藥劑科)

乳腺癌是嚴(yán)重威脅我國婦女健康的惡性腫瘤，疾病負(fù)擔(dān)日益加重，其具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚〔1〕，因此尋找新的治療方案及作用靶點對乳腺癌的預(yù)防和治療具有重要的臨床意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是指長度大于200 bp的不編碼蛋白的RNA，近些年來發(fā)現(xiàn)它與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系〔2〕。LncRNA在腫瘤中異常敏感，可作為腫瘤診斷的特異標(biāo)記物〔3〕。在乳腺癌的研究中，LncRNA多為促癌因子，較少一部分為抑癌因子，研究LncRNA的作用和分子機(jī)制，將為乳腺癌的診斷和治療提供新靶點和新思路〔4〕。尿路上皮癌胚抗原(UCA)1 最初是在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)并命名的一種長鏈非編碼RNA〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)UCA1在膀胱癌〔6〕、乳腺癌〔7〕、黑色素瘤〔8〕等多種腫瘤中表達(dá)異常，能夠通過調(diào)控信號通路或作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA) 影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展及對化療藥物的敏感性〔9〕。

miRNA是一類轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控的非編碼小分子RNA，調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、分化，是潛在的腫瘤分子標(biāo)志物，在腫瘤的早期診斷、治療、預(yù)后判斷及化療耐藥中都有良好的應(yīng)用前景〔10〕。miRNA在肺癌〔11〕、乳腺癌〔12〕和前列腺癌〔13〕等多種腫瘤中差異性表達(dá)顯著。miR-613可作為卵巢癌〔14〕、食管鱗狀細(xì)胞癌〔15〕預(yù)后標(biāo)志物。本研究將探尋LncRNA UCA1通對乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響，分析UCA1和miR-613的靶向關(guān)系。為尋找有效生物靶標(biāo)、實現(xiàn)乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供一定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人乳腺上皮細(xì)胞株HBL-100和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231均購于中科院細(xì)胞庫。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自Takara公司；Trizol、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；MTT試劑盒購自碧云天公司；載體質(zhì)粒由上海生工公司構(gòu)建；細(xì)胞板、酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺上皮細(xì)胞株HBL-100和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，含5% CO2恒溫箱培養(yǎng)。每2～3 d傳代一次。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 取常規(guī)培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231消化后接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%融合，更換為無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為空轉(zhuǎn)染(si-con)組、抑制轉(zhuǎn)染(si-UCA1)組、空轉(zhuǎn)染(miR-con)組、過表達(dá)轉(zhuǎn)染(miR-613)組(轉(zhuǎn)染miR-613 mimics)、空轉(zhuǎn)染(pcDNA)組、過表達(dá)轉(zhuǎn)染(pcDNA-UCA1)組、si-UCA1+anti-miR-con組、si-UCA1+anti-miR-613組，轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM 2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.4qRT-PCR分析UCA1及miR-613表達(dá)水平 按照Trizol說明書提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照AceQ qPCR SYBR? Green Mix說明書進(jìn)行qRT-PCR方法擴(kuò)增。循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.5MTT法測定抑制表達(dá)UCA1、過表達(dá)miR-613和miR-613抑制表達(dá)逆轉(zhuǎn)si-UCA1對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 分別取si-con組、si-UCA1組、miR-con組、miR-613組、si-UCA1+anti-miR-con組和si-UCA1+anti-miR-613組的對數(shù)生長期細(xì)胞消化后，接種于96孔板(5×103個/孔)培養(yǎng)，分別于24 h、48 h和72 h培養(yǎng)時間點，每孔加入20 μl(5 g/ L)的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀測定各孔490 nm波長處光密度(OD)值。每組設(shè)3個復(fù)孔取均值，另設(shè)單孔只加培養(yǎng)基作空白對照。以上實驗重復(fù)3次。

1.6Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 收集si-con組、si-UCA1組、miR-con組、miR-613組、si-UCA1+anti-miR-con組和si-UCA1+anti-miR-613組穩(wěn)定表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基制細(xì)胞懸液，接種于 Transwell 小室上層(3×103個/孔)。Transwell小室風(fēng)干后，加入500 μl 0.1%結(jié)晶紫染色，顯鏡下拍照并計數(shù)發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實驗在Transwell小室上層加入50 μl 2.0 mg/ml基質(zhì)膠，凝固后接種MDA-MB-231細(xì)胞，之后同細(xì)胞遷移操作。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行細(xì)胞的計數(shù)，重復(fù)3次。

1.7熒光素酶報告基因檢測實驗檢測UCA1對miR-613的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示UCA1 3′UTR區(qū)域有miR-613結(jié)合位點。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點UCA1的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-UCA1和MUT-UCA1)，取對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞接種于24孔板(5×104個/孔)，待細(xì)胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-UCA1與miR-613 mimics或miR-con、MUT-UCA1與miR-613 mimics或miR-con。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1UCA1和miR-613在人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá) 與HBL-100細(xì)胞相比，MDA-MB-231細(xì)胞中UCA1的表達(dá)水平顯著升高，miR-613表達(dá)水平顯著下降(均P<0.001)。見表1。

2.2抑制UCA1表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 與si-con組相比，在48 h和72 h時si-UCA1組MDA-MB-231細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)?？梢姡种芔CA1表達(dá)可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖。見表2。

表1 UCA1和miR-613在HBL-100細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)

表2 抑制UCA1表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

2.3抑制UCA1表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與si-con組比較，si-UCA1組乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(均P<0.001)?？梢?，抑制UCA1表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。見表3、圖1。

表3 抑制UCA1表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響

圖1 抑制UCA1表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響(Transwell,×200)

2.4過表達(dá)miR-613對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-con組比較，miR-613組乳腺癌細(xì)胞在48 h和72 h時細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。與miR-con組比較，miR-613組乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(均P<0.001)?？梢姡^表達(dá)miR-613可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。見圖2、表4。

圖2 過表達(dá)miR-613對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響(Transwell，×200)

表4 過表達(dá)miR-613對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.5UCA1靶向調(diào)控miR-613的表達(dá) 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到UCA1與miR-613存在結(jié)合位點(圖3)。熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果(表5)顯示，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-UCA1與miR-613 mimics的細(xì)胞的熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-UCA1與miR-con的細(xì)胞(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染MUT-UCA1與miR-613 mimics的細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染MUT-UCA1與miR-con的細(xì)胞比較差異不顯著。相較于si-con組(0.49±0.06)，si-UCA1組(1.17±0.12)乳腺癌細(xì)胞中miR-613的表達(dá)水平顯著升高；而相較于pcDNA組(0.53±0.06)，pcDNA-UCA1組(0.19±0.03)乳腺癌細(xì)胞中miR-613的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。可見，UCA1是miR-613的靶基因。

圖3 UCA1的3′UTR中含有與miR-613互補(bǔ)的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-613表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制UCA1表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 在48 h和72 h時，與si-con組比較，si-UCA1組MDA-MB-231細(xì)胞活性顯著降低；而與si-UCA1+anti-miR-con組比較，si-UCA1+anti-miR-613組MDA-MB-231細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)。與si-con組比較，si-UCA1組MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著降低；而與si-UCA1+anti-miR-con組比較，si-UCA1+anti-miR-613組MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著升高(P<0.01，P<0.001)。見圖4、表6?？梢?，抑制miR-613表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制UCA1表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

圖4 抑制miR-613表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制UCA1表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的作用(Transwell,×200)

表6 抑制miR-613表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制UCA1表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

3 討 論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，腫瘤的轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌死亡的主要原因〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA在腫瘤診斷和治療方面具有良好的臨床應(yīng)用前景，將成為新型腫瘤診斷標(biāo)志物和腫瘤治療的靶點〔17〕。LncRNA在乳腺中異常表達(dá)、功能失調(diào)，導(dǎo)致正常乳腺功能的異常改變，是乳腺腫瘤形成的重要因素，與它的轉(zhuǎn)移有關(guān)〔18〕。UCA1是一種LncRNA，UCA1水平在人類原發(fā)性乳腺腫瘤中顯著增強(qiáng)，敲低UCA1可抑制蛋白酶B(AKT)磷酸化，消除巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的侵襲性〔19〕。UCA1在膀胱癌中高表達(dá)，且負(fù)向調(diào)節(jié)miRNA-99b〔20〕；UCA1對膀胱癌有高度特異性和敏感性，可作為診斷其標(biāo)記物〔21〕。LncRNA在胃癌中異常高表達(dá)，下調(diào)UCA1可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖〔22〕。在食管癌組織中UCA1差異下調(diào)表達(dá)，或參與食管癌發(fā)生發(fā)展〔23〕。UCA1在肝癌轉(zhuǎn)移過程中高表達(dá)，可作為肝癌轉(zhuǎn)移診斷和病情監(jiān)測的標(biāo)志物〔24〕。UCA1在結(jié)腸癌中上調(diào)表達(dá)，與結(jié)腸癌的進(jìn)展及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)〔25〕。UCA1在胰腺癌組織中高表達(dá)，沉默UCA1可抑制胰腺癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲〔26〕。

miRNA與LncRNA相互作用共同調(diào)控腫瘤進(jìn)展〔27〕，與患者臨床預(yù)防、診療及預(yù)后密切相關(guān)〔28〕。最新研究表明miRNA與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-10b〔29〕、miR-373和miR-520c〔30〕促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，miR-335和miR-126〔31〕則抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。miRNA-613在甲狀腺乳頭狀癌組織中低表達(dá)，與其侵襲性相關(guān)〔32〕。miR-613通過靶向形態(tài)發(fā)生紊亂關(guān)聯(lián)激活因子1/RAS同源基因家族成員A(Daam1/RhoA)信號傳導(dǎo)途徑參與三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲〔33〕。miR-613通過靶向腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)抑制胃癌腫瘤細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，是它的潛在治療靶標(biāo)〔34〕。miR-613在肝細(xì)胞癌中顯著低表達(dá)，與預(yù)后不良有關(guān)〔35〕。miR-613通過靶向Frizzled7抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔36〕。miR-613通過調(diào)節(jié)SphK2抑制乳頭狀甲狀腺癌的細(xì)胞生長，遷移和侵襲〔37〕。

UCA1與miRNA之間相互作用可以調(diào)控相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。UCA1通過競爭性抑制miR-18a增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的他莫昔芬治療耐藥〔38〕。UCA1通過阻止miR-18a抑制YAP1使乳腺癌細(xì)胞對曲妥珠單抗脫敏〔39〕。UCA1通過與p27 mRNA競爭異質(zhì)性細(xì)胞核核糖核蛋白(hnRNP)I來抑制p27蛋白水平而促進(jìn)乳腺腫瘤生長〔7〕。在膀胱癌細(xì)胞中UCA1負(fù)向調(diào)節(jié)miRNA-99b的表達(dá)〔40〕。miR-216b在體外培養(yǎng)細(xì)胞中加速UCA1的降解〔41〕；上調(diào)的UCA1通過抑制miR-216b和激活成纖維細(xì)胞生長因子受體1/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(FGFR1/ERK)信號通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展〔42〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-613在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，說明其可能參與調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。通過轉(zhuǎn)染miR-613 mimics研究了miR-613對結(jié)腸癌乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-613可以抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在MDA-MB-231細(xì)胞中同時轉(zhuǎn)入si-UCA1和miR-613抑制表達(dá)質(zhì)粒，可逆轉(zhuǎn)si-UCA1的增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，LncRNA UCA1可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與靶向miR-613有關(guān)，為乳腺癌的靶向治療提供新靶點。