黃芩素通過Ezrin相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對喉癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響

孫吉鳳 何海濤

(1長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長春 130031;2吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤，統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明全世界每10萬人中有5.1～10.0 例喉癌患者〔1〕，約60%的喉癌患者確診時已處于Ⅲ期或Ⅳ期〔2〕,手術(shù)仍是喉癌治療的主要手段，手術(shù)切除輔助放療、化療、新型靶向治療等綜合手段治療也越來越多被采用〔3,4〕，我國目前90.34%的喉癌患者生存率不超過5年，且復(fù)發(fā)、浸潤和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素〔5〕。

Ezrin與腫瘤轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系，相關(guān)研究越來越受到學(xué)者重視〔6〕。有研究表明〔7,8〕，Ezrin在喉癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)高于原發(fā)灶，在促進喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中表達(dá)量持續(xù)增高，但深入的相關(guān)分子機制研究目前尚未見報道。中藥黃芩在治療喉癌方面的作用早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中即有介紹〔9〕。黃芩素(BAI) 作為黃芩的主要有效成分，在抗腫瘤方面的研究近年也有報道〔10〕，本科研團隊孫吉鳳等〔11〕研究表明BAI可以影響喉癌Hep-2細(xì)胞周期分布，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究表明，Ezrin在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的高表達(dá)與腫瘤侵襲相關(guān)〔12〕。本研究擬分析BAI通過調(diào)節(jié)Ezrin相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對喉癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料及方法

1.1細(xì)胞與試劑 人喉癌Hep-2 細(xì)胞株購于上海細(xì)胞生物研究所。BAI購于美國SIGMA公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶等細(xì)胞培養(yǎng)用試劑購于美國Gibco/BRL公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于北京鼎國生物技術(shù)公司，Transwell小室購于美國Corning-Costar公司，Trizol 試劑購于美國Invitrogen 公司，Prime Scri PtRT Master Mix 購于Takara公司，Ezrin、RhoA基因引物由Takara公司合成，p-Ezrin、Ezrin、RhoA抗體購于美國Santa Cruz公司，GAPDH抗體、二抗購于博士德公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購于凱基生物技術(shù)公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 喉癌Hep-2細(xì)胞株于含10% FBS、100 U/ ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，全濕度，5%CO2孵箱中傳代培養(yǎng)，實驗選擇對數(shù)期細(xì)胞。

1.3MTT實驗 收集對數(shù)期生長的喉癌Hep-2細(xì)胞，按細(xì)胞濃度為5×104個/孔，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔加100 μl 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，加入終濃度分別為10、20、40、80 μmol/L的BA繼續(xù)培養(yǎng)；設(shè)陰性對照組(只加入溶劑DMSO)及設(shè)空白對照組；每組設(shè)5個平行復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后,每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，孵育4 h，棄上清，加入150 μl DMSO,振蕩，待藍(lán)紫色結(jié)晶物完全溶解后,酶標(biāo)儀在490 nm 波長處檢測各孔吸光值(A)。細(xì)胞增殖抑制率(IR)=(1-藥物作用組平均A/對照組平均A)× 100% ，并計算出BAI的50%抑制濃度(IC50)。

1.4劃痕愈合實驗 取對數(shù)期生長的喉癌Hep-2細(xì)胞,按細(xì)胞濃度為2×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后使其形成單層細(xì)胞。用 200 μl無菌槍頭垂直于板底給6孔板中的細(xì)胞劃痕，記錄劃痕區(qū)相對距離。用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去脫落細(xì)胞,分別加入BAI溶液(終濃度為10、20、40 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，觀察并拍照，在倒置顯微鏡下測量細(xì)胞向劃痕區(qū)遷移的相對距離，并計算細(xì)胞遷移率。0 h時劃痕寬度作為對照組，細(xì)胞遷移率 = (對照組劃痕寬度-實驗組劃痕寬度)/0 h時劃痕寬度×100%。每組設(shè)3個復(fù)孔，設(shè)陰性對照組，實驗重復(fù)3次。

1.5Transwell侵襲實驗 將基質(zhì)膠鋪于 Transwell 小室的上室，并于 37℃環(huán)境孵育1 h。取對數(shù)期生長的喉癌Hep-2細(xì)胞，用無血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/L ，將200 μl細(xì)胞懸液加至 Transwell小室(孔徑8 μm)上室，各實驗組分別加入BAI溶液(終濃度10、20、40 μmol/L)，同時設(shè)陰性對照組。下室加入600 μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后,去除上下層培養(yǎng)液,將 Transwell 小室取出，用棉簽擦去小室表面未侵襲的細(xì)胞和基質(zhì)膠，用甲醇固定20 min，PBS洗滌2次，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，PBS洗滌2次，待其自然晾干后,倒置顯微鏡下隨機選取5個視野拍照,統(tǒng)計各組穿膜的平均細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞侵襲抑制率，細(xì)胞侵襲抑制率=(對照組穿膜細(xì)胞數(shù)-實驗組穿膜細(xì)胞數(shù))/ 對照組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6RT-qPCR檢測 取對數(shù)期生長的喉癌Hep-2細(xì)胞分別加入BAI(終濃度為20、40、80 μmol/L)，設(shè)陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h或48 h，用Trizol裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，利用微量分光光度計檢測A260/A280鑒定提取純度，定量后各組取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用Real-Time PCR儀進行熒光實時定量PCR反應(yīng)，按照試劑盒操作說明書進行20 μl反應(yīng)體系反應(yīng)。各基因的合成引物分別為：Ezrin正義鏈5′-TGGGATGCTCAAAGATAATGC-3′,反義鏈5′-ACTCCAAGCCAAAGGTCTGTT-3′;RhoA正義鏈5′-TTCAGCAAAGACCAA-AGATGGA-3′,反義鏈5′-CACAAGACAAGGCACCCAGA-3′,以GAPDH為內(nèi)參GAPDH正義鏈5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′,反義鏈5′-ATGGTGGT-GAAG-ACGCCAGGTA-3′。

1.7Western印跡檢測 取對數(shù)期生長的Hep-2細(xì)胞加入終濃度為40、80 μmol/L的BAI，設(shè)陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h或48 h，按試劑說明書操作，收集細(xì)胞，PBS洗滌后，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，收集上清液，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取含50 μg總蛋白樣本與十二烷基硫酸鈉(SDS)混合變性后，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。電泳后蛋白轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后5%脫脂牛奶4℃ 搖床封閉；充分洗膜后，加稀釋后的p-Ezrin、Ezrin、RhoA和內(nèi)參GAPDH抗體(按1∶1 000稀釋)4℃ 孵育過夜；充分洗膜后，加稀釋后的HRP-鼠抗兔IgG(按1∶2 000稀釋)37℃ 孵育2 h；充分洗膜后，加ECL顯色定影；之后利用BIO-RAD凝膠成像及分析系統(tǒng)對各蛋白條帶進行分析，實驗反復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 軟件進行方差分析、t檢驗，用 Graph Pad Prism 進行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1BAI對Hep-2細(xì)胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，與陰性對照相比，BAI(10、20、40、80 μmo/L)作用 24、48、72 h后，對各組細(xì)胞增殖均具有抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 BAI作用不同時間對Hep-2細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2BAI對Hep-2細(xì)胞遷移能力的影響 與陰性對照組相比，24、48 h各濃度細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.05)；且相同濃度組的細(xì)胞遷移率，隨作用時間增加而降低。見表2。

2.3BAI對Hep-2細(xì)胞侵襲能力的影響 BAI處理組穿膜細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。與陰性對照組相比，BAI作用24 h 后，各濃度組穿膜細(xì)胞數(shù)逐漸減少，細(xì)胞侵襲率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 BAI對 Hep-2細(xì)胞遷移能力的影響

2.4BAI對 Hep-2細(xì)胞Ezrin、RhoA基因 mRNA表達(dá)的影響 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與陰性對照相比，BAI(20、40、80 μmol/L)作用 24、48 h后，各組細(xì)胞Ezrin、RhoA基因 mRNA相對表達(dá)量下降。組間比較隨BAI濃度及作用時間的增加，Ezrin、RhoA mRNA表達(dá)相對密度顯著降低(P<0.05)。見表4。

表3 BAI對Hep-2細(xì)胞侵襲能力的影響

表4 BAI對 Ezrin、RhoA mRNA相對表達(dá)的影響

2.5BAI對p-Ezrin、Ezrin、RhoA蛋白表達(dá)的影響 與陰性對照組相比，40、80 μmol/L BAI作用24 h后磷酸化Ezrin(p-Ezrin)蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；但40 μmol/L BAI作用組與80 μmol/L BAI作用組間差異無顯著意義(P>0.05)；40、80 μmol/L BAI作用后Ezrin蛋白表達(dá)明顯低于對照組，且隨濃度升高表達(dá)降低(P<0.05)；40、80 μmol/L BAI作用后RhoA蛋白表達(dá)明顯低于對照組，且隨濃度升高表達(dá)降低(P<0.05)。與陰性對照組相比，40、80 μmol/L BAI作用48 h后p-Ezrin、Ezrin、RhoA蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，且各48 h作用組蛋白表達(dá)量明顯低于24 h(P<0.05)。見圖1、表5。

圖1 BAI對各組細(xì)胞Ezrin、p-Ezrin、RhoA蛋白表達(dá)的影響

表5 BAI對 p-Ezrin、Ezrin、RhoAm蛋白相對表達(dá)的影響

3 討 論

BAI是黃芩的主要有效成分，近年其抗乳腺癌、宮頸癌、甲狀腺癌等作用被報道。本研究團隊前期研究結(jié)果表明，黃芩素具有影響細(xì)胞周期分布、誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡方面的作用〔11,13〕。

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡失衡密切相關(guān)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖也是抗腫瘤的主要研究方向。本研究結(jié)果表明，BAI對喉癌Hep-2 細(xì)胞具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。

我國目前絕大部分的喉癌患者5年生存率較低，其中癌細(xì)胞的浸潤和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移是影響喉癌預(yù)后、生存率的關(guān)鍵因素。因此抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是提高生存率的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明，BAI可以抑制喉癌Hep-2 細(xì)胞遷移能力及侵襲能力。

腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移是多系統(tǒng)、多步驟和多因素作用的結(jié)果。近年來，Ezrin與腫瘤轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系，越來越受到學(xué)者重視，成為抗腫瘤治療的全新靶點〔6～8〕。Ezrin是ERM家族蛋白最早被發(fā)現(xiàn)的，ERM家族蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架重塑及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲等。Ezrin 參與許多細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程，研究表明Ezrin的異常表達(dá)及磷酸化與多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔7〕。有研究顯示Ezrin在喉癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)高于原發(fā)灶，其與促進喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔12〕。但深入的相關(guān)分子機制研究目前尚未見報道。本研究結(jié)果表明BAI呈濃度-時間依賴性，抑制喉癌Hep-2 細(xì)胞Ezrin基因及p-Ezrin的表達(dá)。Ezrin蛋白的磷酸化激活是Ezrin發(fā)揮其對細(xì)胞骨架動態(tài)循環(huán)調(diào)控功能的必需條件，結(jié)合BAI抑制喉癌Hep-2 細(xì)胞遷移能力及侵襲能力的結(jié)果，說明BAI可以通過抑制Ezrin在mRNA、蛋白水平表達(dá)及Ezrin磷酸化，可能與抑制喉癌Hep-2 細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)。

RhoA是一種結(jié)構(gòu)較為保守的單體G蛋白，具有GTP酶活性，研究已經(jīng)證實，RhoA作為Ezrin上游活化信號通路及下游相互作用蛋白之一，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤轉(zhuǎn)移等過程〔14〕。有研究表明，RhoA在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)增加，且其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、浸潤程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期密切相關(guān)〔12〕。本研究結(jié)果表明BAI可以抑制喉癌細(xì)胞中RhoA基因的表達(dá)。RhoA是 Ezrin上游調(diào)控因子，活化的RhoA通過介導(dǎo)細(xì)胞表面分子RhoA/ROCK-I信號通路促進Ezrin的磷酸化，促進Ezrin活化，增強 Ezrin與細(xì)胞骨架的聯(lián)系，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用?；罨腅zrin同時可以正反饋調(diào)控RhoA，Ezrin可以通過與Rho-GDI結(jié)合從而活化RhoA，也可以通過激活 Rac1從而激活Rho信號通路。

綜上，BAI可以抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的遷移、侵襲，這可能與抑制RhoA在mRNA和蛋白水平的表達(dá)有關(guān)，進而抑制RhoA/ROCK-I信號通路，抑制Ezrin的磷酸化，進而抑制Ezrin的表達(dá)；此外，對Ezrin表達(dá)的抑制作用，將抑制Ezrin與Rho-GDI結(jié)合，抑制RhoA活化，也可以抑制Rac1激活，從而抑制Rho信號通路，抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的遷移、侵襲。