響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合澄清劑澄清山藥醋工藝

王美洪，陳善敏，許 洋，蔣和體，*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715;2.食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶400715)

山藥(Rhizoma dioscoreae)，薯蕷科草本植物，含有皂苷、膽堿、糖蛋白和多種氨基酸，還有抗性淀粉、黃酮、尿囊素等活性保健成分［1－2］，有抗氧化、抗癌活性和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等藥理作用［3］。由于山藥資源豐富，淀粉含量高，而且不具備分解纖維素和水解蛋白質(zhì)的酶系統(tǒng)［4］，其作為一種優(yōu)良的保健醋發(fā)酵原料，既可滿足廣大消費(fèi)者需求，也拓寬山藥銷售市場(chǎng)，減少其在運(yùn)輸過(guò)程的腐爛敗壞，提高山藥的綜合利用率。

原料山藥在釀造過(guò)程糖化不完全的殘留物以及殺菌過(guò)程不徹底的粘稠產(chǎn)物，在裝瓶后會(huì)變性或聚集，從而使果醋在自然條件下難以澄清、易二次反濁、失光［5－6］，山藥醋的澄清勢(shì)在必行，以山藥為原料進(jìn)行破碎、打漿、調(diào)整成分、發(fā)酵，通過(guò)添加不同的澄清劑對(duì)山藥醋進(jìn)行澄清處理，山藥醋中的大分子物質(zhì)被吸附，進(jìn)而達(dá)到果醋澄清的目的。

陳珍金等［7］利用明膠對(duì)液態(tài)發(fā)酵柿子醋進(jìn)行澄清，發(fā)現(xiàn)明膠添加量為3%－5%時(shí)，柿子醋澄清和除澀效果較好。盧維奇等［8］用幾丁質(zhì)－麥飯石復(fù)合物澄清保健醋，發(fā)現(xiàn)兩澄清劑間存在協(xié)同作用使醋獲得良好澄清效果，且澄清后醋主要理化營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)并無(wú)改變。目前對(duì)山藥這種兼具藥食同源的淀粉物質(zhì)制作的保健醋產(chǎn)品極少，且對(duì)造成其商品價(jià)值下降的澄清技術(shù)的研究幾乎沒(méi)有。本試驗(yàn)在單一澄清劑基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面模型優(yōu)化最佳澄清條件，以透光率為參考指標(biāo)，考察硅藻土和殼聚糖復(fù)合澄清的最適條件組合對(duì)山藥醋的澄清效果，以期為山藥醋澄清工藝提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試山藥 產(chǎn)自河南省商丘市，購(gòu)于重慶市北碚區(qū)天生麗街永輝超市，選用同批次大小均一、無(wú)機(jī)械損傷和病害的新鮮山藥;酵母1383 實(shí)驗(yàn)室4℃保藏;巴氏醋桿菌巴氏亞種1.41(Acetobacter pasteurianus subsp.Pasteurianus 1.41) 購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理中心;殼聚糖 廣東鹿鳴食業(yè)有限公司;硅藻土 河南順鑫食化生物科技;明膠 河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司(以上均為分析純);果膠酶(2000 U/g)諾維信生物技術(shù)有限公司。

UNICO－7200分光光度計(jì) 上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司;HWS－26電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器廠;PHS－3C酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠;PAL－1手持糖度儀 上海上天精密儀器有限公司;HDL－4臺(tái)式離心機(jī) 常州市鴻科儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山藥醋的發(fā)酵工藝流程和操作要點(diǎn)

1.2.1.1 工藝流程 參考文獻(xiàn)［9］。

1.2.1.1 操作要點(diǎn) 打漿酶解:將蒸熟后的山藥去皮后按料液比1∶4(g∶mL)混合打漿后，等比加入0.15%葡萄糖淀粉酶(酶活50000 IU/g)和α－淀粉酶(酶活100000 IU/g)水浴鍋65℃糖化2 h后糖度為22%。

酒精發(fā)酵:糖化后的山藥漿在450W下微波滅酶2.5 min后調(diào)糖度到25%，高壓蒸汽滅菌后加入已活化的酵母菌擴(kuò)培液，經(jīng)28℃發(fā)酵24 h后換發(fā)酵栓，再25℃發(fā)酵6 d，發(fā)酵后測(cè)得酒精度13%，殘?zhí)橇?.35 g/100 mL。

醋酸發(fā)酵:山藥酒經(jīng)過(guò)濾后，調(diào)節(jié)酒精度為7%，在121℃、15 min條件下對(duì)原酒進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后，加入15%活化后的巴氏醋酸桿菌擴(kuò)培液，在30℃、120 r/min搖床條件下發(fā)酵，每隔12 h取樣測(cè)定酸值，至總酸值增長(zhǎng)緩慢停止醋酸發(fā)酵。

澄清［10－12］:以澄清劑復(fù)配比例、添加量、澄清時(shí)間和澄清溫度四個(gè)因素對(duì)山藥醋的澄清工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到品質(zhì)優(yōu)良的山藥醋。

1.2.2 山藥醋澄清條件優(yōu)化

1.2.2.1 單一澄清劑澄清 分別采用配制成10%的硅藻土、果膠酶、殼聚糖、明膠澄清劑溶液以1、2、3、4、5、6 g/L加入到20 mL山藥醋中混合均勻，于40℃恒溫水浴鍋中靜置60 min，經(jīng)3000 r/min離心12 min后，取上清液在480 nm處［13］測(cè)定透光率，同時(shí)做三組平行。

1.2.2.2 復(fù)合澄清劑澄清條件優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn) 以單因素結(jié)果篩選出兩種效果最好的澄清劑做復(fù)合試驗(yàn)，分別考察復(fù)合澄清劑配比、復(fù)合澄清劑總添加量、澄清溫度和澄清時(shí)間對(duì)山藥醋澄清效果的影響。

硅藻土與殼聚糖復(fù)合澄清劑按混合比5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、2∶3(g∶g)，總添加量3 g/L加入到20 mL山藥醋中混合均勻，在40℃下保溫60 min，3000 r/min離心12 min后，取上清液在480 nm處測(cè)定其透光率，確定復(fù)合澄清劑最佳配比。

以復(fù)合澄清劑配比1∶1，復(fù)合澄清劑總添加量按照1、2、3、4、5、6 g/L加入到20 mL山藥醋中混合均勻，在40℃下保溫60 min，經(jīng)離心后，取上清液測(cè)定其透光率，確定最適復(fù)合澄清劑總添加量。

以復(fù)合澄清劑配比1∶1，總添加量3 g/L加入到20 mL山藥醋中混合均勻，分別在25、30、35、40、45、50℃靜置60 min，離心后取上清液在480 nm處測(cè)定其透光率，確定最佳澄清溫度。

以復(fù)合澄清劑配比1∶1，總添加量3 g/L加入到20 mL山藥醋中，混合均勻，在40℃下分別對(duì)山藥醋保溫20、40、60、80、100、120 min。離心后取上清液測(cè)定其透光率，確定最佳澄清時(shí)間。

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Range and corresponding levels of independent variables

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以澄清溫度(A)、復(fù)合澄清劑配比(B)、澄清時(shí)間(C)和復(fù)合澄清劑添加量(D)為自變量，山藥醋透光率為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行Box－Behnken中心組合試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素見(jiàn)表1。

1.2.4 理化指標(biāo)檢測(cè) 透光率:可見(jiàn)分光光度法;可溶性固形物:采用手持式糖度計(jì)測(cè)定;殘?zhí)?參照GB/T 5009.7－2008《食品中還原糖的測(cè)定》;總酸:參照GB/T 12456－2008《食品中總酸的測(cè)定》;氨基酸態(tài)氮:參照GB/T 12143－2008《飲料通用分析方法》。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，運(yùn)用Excel 2016、GraphPad prism 8和Designexpert 8.06軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同澄清劑對(duì)山藥醋澄清效果影響 據(jù)透光率指標(biāo)分析，四種澄清劑均對(duì)山藥醋澄清有效果，隨澄清劑濃度增加，透光率逐漸增大，當(dāng)硅藻土、殼聚糖和明膠添加量分別為4、5、4 g/L時(shí)，透光率分別為80.1%、78.3%和77.6%，對(duì)醋體澄清效果較好;當(dāng)果膠酶添加量為2 g/L時(shí)，山藥醋透光率達(dá)到最大值75.4%，較前三種澄清劑效果略差，而過(guò)多的澄清劑則會(huì)懸浮于醋體中讓透光率不增反減［14－15］。雖然殼聚糖和明膠對(duì)提高山藥醋澄清度并無(wú)顯著差別，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)明膠澄清后的山藥醋略帶異味，這與饒炎炎等［16］發(fā)現(xiàn)明膠添加過(guò)多會(huì)使果汁變色變味一致。最終選擇硅藻土和殼聚糖作為復(fù)合澄清劑。

圖1 不同澄清劑對(duì)山藥醋澄清效果影響Fig.1 Effects of different clarifiers on clarification effect of yam vinegar

2.1.2 復(fù)合澄清劑對(duì)山藥醋澄清效果影響的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同復(fù)合澄清劑配比對(duì)澄清效果有較大影響。當(dāng)澄清劑配比為2∶1時(shí)，山藥醋透光率為91.1%，說(shuō)明適合的澄清劑配比對(duì)澄清效果有增效作用;隨著配比的增大，澄清劑間不同電荷渾濁物的互補(bǔ)效果被破壞［17］，透光率也隨之下降，因此選擇澄清劑配比為2∶1。

隨復(fù)合澄清劑添加量的增加，醋體中的小分子物質(zhì)絮凝，透光率也相應(yīng)增大，當(dāng)復(fù)合澄清劑添加量為4 g/L時(shí)，透光率達(dá)到90.6%，此后澄清劑吸附能力到飽和，膠體物質(zhì)被充分沉淀［20－22］，過(guò)量澄清劑懸浮于醋體而導(dǎo)致渾濁，因此選擇復(fù)合澄清劑添加量為4 g/L。

山藥醋透光度隨溫度逐漸增大，當(dāng)澄清溫度為35℃時(shí)，透光率達(dá)最大值91.6%，說(shuō)明適宜溫度既促進(jìn)硅藻土多孔結(jié)構(gòu)對(duì)醋體中色素、酵母等懸浮物的吸附作用，也增強(qiáng)了硅藻土和殼聚糖之間的相互作用，形成穩(wěn)定的熱力學(xué)體系［18－19］，而過(guò)高溫度則會(huì)影響醋中沉降顆粒物質(zhì)的穩(wěn)定性，從而使醋體渾濁，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇澄清溫度為35℃。

圖2 單因素變量對(duì)山藥醋澄清效果的影響Fig.2 Effects of single factor variable on clarification effect of yam vinegar

表2 山藥醋響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results of yam vinegar

表3 回歸模型顯著性結(jié)果Table 3 Significance test for regression model

澄清時(shí)間在20～60 min時(shí)，透率光從80.5%增至87.8%，增幅明顯，此時(shí)澄清劑與山藥醋中與相應(yīng)物質(zhì)發(fā)生靜電、沉降、分解等作用［23］，加速了醋中色素的吸附和酵母、蛋白質(zhì)等懸浮顆粒的沉淀，此后透光率穩(wěn)定在90.2%左右，說(shuō)明醋體中渾濁物質(zhì)基本被凝聚沉降，醋體得以澄清。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中生產(chǎn)成本及能耗等因素，最終選擇澄清時(shí)間為80 min左右。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合澄清條件 為確定澄清工藝的最佳條件，本試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合澄清劑對(duì)山藥醋的澄清效果，研究自變量及其交互作用對(duì)山藥醋澄清效果的影響，確定最佳澄清工藝參數(shù)。

用Design Expert 8.06軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合［24－25］，獲得山藥醋透光率的數(shù)學(xué)模型的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=95.56+1.29A+0.88B+1.71C－1.13D－0.20AB+0.15AC－0.85BC+0.45BD+0.53CD－1.32A2－1635B2－2.04C2－1.63D2

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)山藥醋透光率的模擬方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 各因素交互作用對(duì)透光率影響的響應(yīng)面Fig.3 Response surface of interaction of various factors on transmittance

由表3可知，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型決定系數(shù)R2=0.9859，說(shuō)明回歸方程有較高擬合度和相關(guān)性，模型預(yù)測(cè)值能較好地反映實(shí)際值［26］，可以對(duì)復(fù)合澄清劑優(yōu)化澄清山藥醋的條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。模擬項(xiàng)的A、B、C、D、AD、BC、A2、B2、C2、D2達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，BD、CD達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。AB、AC對(duì)響應(yīng)值均無(wú)顯著影響。各因素透光率的影響順序分別是:澄清時(shí)間＞澄清溫度＞澄清劑添加量＞復(fù)合澄清劑配比(硅藻土∶殼聚糖)。

2.2.2 因素交互作用分析 交互作用分析中等高線圖能夠直接反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響及各因素間相互作用的強(qiáng)弱，各因素交互作用對(duì)透光率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可得，響應(yīng)面均向下開(kāi)口且曲面較陡，透光率隨各因素的增大呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，澄清溫度和澄清時(shí)間、澄清溫度和復(fù)合澄清劑配比的交互作用響應(yīng)面圖等高線呈圓形，說(shuō)明其交互作用不顯著;而澄清時(shí)間和澄清劑添加量、復(fù)合澄清劑配比和添加劑添加量、復(fù)合澄清劑配比和澄清時(shí)間、澄清溫度和澄清劑添加量的響應(yīng)面圖等高線呈橢圓形，說(shuō)明其交互作用對(duì)透光率的影響較顯著，這與表3中結(jié)果相符合。

2.2.3 山藥醋最佳澄清效果的條件驗(yàn)證試驗(yàn) 采用Design－Expert 8.06軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出最佳澄清條件:溫度36.38℃，復(fù)合澄清劑配比硅藻土∶殼聚糖為2.33∶1時(shí)，澄清時(shí)間83.01 min，復(fù)合澄清劑添加量3.75 g/L，此條件下山藥醋透光率預(yù)測(cè)值96.11%，考慮實(shí)踐操作簡(jiǎn)便性并檢驗(yàn)其合理性，取硅藻土與殼聚糖配比5∶2(g∶g)、復(fù)合澄清劑添加量}澄清溫度36.5℃、澄清時(shí)間83 min下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)三次取均值，得到山藥醋透光率為95.8%，基本接近預(yù)測(cè)值。證明該模型優(yōu)化復(fù)合澄清劑澄清山藥醋的條件的可行性和有效性。

2.3 山藥醋澄清效果及品質(zhì)評(píng)價(jià)

選擇硅藻土和殼聚糖這兩種澄清劑，分別在最佳條件下對(duì)山藥醋進(jìn)行單一和復(fù)合處理，測(cè)定其基本理化指標(biāo)。由表4可知，單一澄清劑中硅藻土對(duì)山藥醋的澄清效果最好，透光率高達(dá)80.1%，同時(shí)能較好地保持山藥醋中可溶性固形物、總酸和氨基酸態(tài)氮的含量，殼聚糖的澄清效果僅次于硅藻土，透光率達(dá)到78.3%，但其對(duì)氨基酸態(tài)氮的保存率低于硅藻土，可能原因是殼聚糖和蛋白質(zhì)之間存在氫鍵形式的靜電引力，其相互作用會(huì)加速蛋白質(zhì)和游離氨基酸的吸附［27］。復(fù)合澄清劑的澄清效果明顯優(yōu)于其他單一澄清劑，透光率達(dá)到95.8%，澄清后醋體澄淺黃棕，清透有光澤，帶有濃郁醋香，口感酸而不澀無(wú)雜物，同時(shí)能夠較好地保存山藥醋的品質(zhì)，因此，復(fù)合澄清是山藥醋的最佳澄清方法。

表4 山藥醋的理化指標(biāo)Table 4 Physical and chemical indexes of yam vinegar

3 結(jié)論

山藥醋中含有蛋白質(zhì)、酵母、色素、單寧等大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)造成醋體渾濁、不穩(wěn)定［28－30］。通過(guò)不同的澄清劑處理山藥醋，比較其透光率以及各項(xiàng)指標(biāo)，可知復(fù)合澄清劑處理山藥醋的澄清效果明顯優(yōu)于單一澄清劑，最佳澄清條件為:硅藻土與殼聚糖配比5∶2，澄清溫度為36.5℃，澄清時(shí)間為83 min，復(fù)合澄清劑添加量4 g/L。在此條件下，經(jīng)驗(yàn)證性試驗(yàn)得出山藥醋澄清的透光率為最大值，達(dá)到95.8%，比原醋升高了27%，同時(shí)對(duì)山藥醋其他各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯影響，氨基酸態(tài)氮0.27 g/100 mL，總酸5.29 g/100 mL，可溶性固形物8.74°Bx，處理后的山藥醋呈淺黃棕，色澤均勻透亮，醋味酸感柔和。