冷藏卵形鯧鲹優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定及致腐能力分析

于淑池，楊 毅，2，馮紫藍(lán)，梁宇晴，徐小雄，裴志勝，楊 波

(1.海南熱帶海洋學(xué)院，食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南三亞572022;2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003)

卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)又名金鯧，系鱸形目鯧鲹屬，廣泛分布于廣東、廣西、海南等東南沿海［21，是我國近年來新增的養(yǎng)殖海洋經(jīng)濟(jì)魚種［2］;據(jù)2019年首屆中國金鯧魚產(chǎn)業(yè)高峰論壇數(shù)據(jù)顯示，卵形鯧鲹的養(yǎng)殖產(chǎn)量已突破15萬噸以上，產(chǎn)值近100億元;卵型鯧鲹肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，無肌間刺，是加工魚塊的優(yōu)良材料［3］;同時(shí)其富含水分、蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，在加工和貯藏過程中易腐敗變質(zhì)，微生物是導(dǎo)致其腐敗的主因［4］。

水產(chǎn)品的腐敗過程中只有部分優(yōu)勢細(xì)菌能大量增殖，在貯藏末期占據(jù)主導(dǎo)地位并最終導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，這些產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物(臭味、異味、顏色)的優(yōu)勢微生物被稱為優(yōu)勢腐敗菌(dominant spoilage bacteria)或特定腐敗菌(Specific Spoilage Organism，SSO)［5］。在凍結(jié)溫度以上，水產(chǎn)品特定腐敗菌(SSOs)的生長繁殖主導(dǎo)著魚肉腐敗變質(zhì)的程度［6］。不同水產(chǎn)品中的特定腐敗菌存在差異，魚類捕獲后到貨架期終點(diǎn)，特定腐敗菌的組成因魚種、捕獲季節(jié)、水域和貯藏條件等不同而異，但在貯藏條件不變的情況下，每種水產(chǎn)品都有其固定的特定腐敗菌［7］。目前已經(jīng)確定了冷藏條件下大黃魚、大菱鲆、鯉魚、羅非魚、南美白對蝦、鷹爪蝦、太平洋牡蠣、三文魚和鯧魚等多種水產(chǎn)品的特定腐敗菌［8］，卵型鯧鲹優(yōu)勢腐敗菌的研究僅年益瑩等［9］采用酸化減菌處理，測定了微凍(－3℃)貯藏條件下金鯧魚塊菌落總數(shù)、菌相變化，但4℃冷藏條件下卵形鯧鲹優(yōu)勢腐敗菌的研究還未見報(bào)道。

特定腐敗菌與水產(chǎn)品貨架期密切相關(guān)［5］，是水產(chǎn)品品質(zhì)控制的關(guān)鍵點(diǎn);因此確定優(yōu)勢腐敗菌對靶向控制其冷藏腐敗變質(zhì)具有重要意義。一種水產(chǎn)品通常只有一種或幾種特定腐敗菌，在貯藏初期，數(shù)量和種類并不占優(yōu)勢，但它們的生長繁殖速度快，到貯藏末期在數(shù)量與比重上占絕對優(yōu)勢，且腐敗活性強(qiáng)［10］，因此SSOs的是貯藏末期的數(shù)量優(yōu)勢菌，同時(shí)又具備較強(qiáng)的產(chǎn)生異味的定性能力(腐敗潛在性)和產(chǎn)生腐敗代謝物的定量能力(腐敗能力)［11］。近年來，國內(nèi)外部分學(xué)者開始利用腐敗菌產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物作為其腐敗能力的定量指標(biāo)［12］。TVB－N、生物胺、三甲胺等腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子均可作為水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌致腐敗能力定量分析的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［13］。本研究以卵形鯧鲹為原料，對4℃冷藏卵形鯧鲹貯藏期間腐敗細(xì)菌進(jìn)行篩選純化、菌相分析及部分生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)合16S rDNA技術(shù)鑒定腐敗菌，以腐敗物質(zhì)的產(chǎn)量因子YTVB－N/CFU為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，定量評價(jià)貯藏末期的優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力，最終確定冷藏卵形鯧鲹的優(yōu)勢腐敗菌;以期為卵形鯧鲹腐敗菌的靶向控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮卵形鯧鲹(體質(zhì)量600±10 g)購于三亞市勝利路旺毫超市，保持鮮活狀態(tài)在30 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室;平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(Plate count agar，PCA)、假單胞菌選擇性培養(yǎng)基(Pseudomonas CFC Selective Agar，CFC)、鐵瓊脂培養(yǎng)基(Iron Agar，IA)、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Violet Red Bile Agar，VRBGA)、乳酸菌分離培養(yǎng)基(Lactobacilli MRS Broth，MRS)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(Trypticase Soy Agar，TSA)、細(xì)菌普通培養(yǎng)基(Luria－Bertani，LB) 青島海博生物技術(shù)有限公司;NaCl、HCl、無水乙醇、硼酸 均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司;革蘭氏染液試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;氧化鎂 分析純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;胰蛋白胨、大豆蛋白胨 奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;酵母浸膏 茂捷微生物科技有限公司;甲基紅指示劑 福晨化學(xué)試劑廠;亞甲基藍(lán)指示劑 天新精細(xì)化工開發(fā)中心;過氧化氫 分析純，富宇精細(xì)化工有限公司;PCR擴(kuò)增試劑及引物華大基因;丙三醇 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;孔雀石綠 上海麥克林生化科技有限公司;氧化酶試紙 杭州市西湖區(qū)奧圖實(shí)驗(yàn)儀器經(jīng)營部。

SQ510C型立式壓力蒸汽滅菌器 重慶雅馬拓科技有限公司;FA2204B型電子天平 上海天美天平儀器有限公司;LRH－250F型生化培養(yǎng)箱 金壇市盛蘭儀器制造有限公司;SWC－FD型潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Kjeltec2300型凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司;icount全自動菌落計(jì)數(shù)儀杭州迅數(shù)科技有限公司;Multifuge X1R型高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技(上海)有限公司;BCD－290W型冰箱 青島海爾股份有限公司;BM2000型電子顯微鏡 南京江南永新光學(xué)有限公司;ZQIY70N臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;Mastercycler6325PCR擴(kuò)增儀 EPPENDORF中國有限公司;PowerPac Basic電泳儀、Universal Hood II凝膠成像儀 BIO－RAD中國有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理 鮮活卵形鯧鲹用冰水混合物致死，清水沖去表面粘液，經(jīng)去頭、去尾、去內(nèi)臟“三去”處理后，取背部肌肉，切成(50±0.2)g魚片，放入托盤中覆蓋保鮮膜，置于(4±0.5)℃冰箱冷藏6 d［14］;分別于初期(0 d)、中期(3 d)、后期(6 d)取貯藏的魚片進(jìn)行腐敗細(xì)菌的分離純化及鑒定。

1.2.2 細(xì)菌分離純化 分別于4℃冷藏的初期(0 d)、中期(3 d)、后期(6 d)，取4℃冷藏卵形鯧鲹魚片5 g左右置于超凈臺內(nèi)，在無菌操作環(huán)境下放入滅過菌的研缽中，加入海砂將魚肉研碎，加無菌生理鹽水45 mL，搖床振蕩30 min后，取l mL進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇3個(gè)合適的稀釋度(10－4、10－5、10－6)，每個(gè)稀釋度取100μL菌液，均勻涂布于6種不同選擇培養(yǎng)基上，其中PCA、IA、CFC、TSA等培養(yǎng)基選擇30℃培養(yǎng)48 h，MRS、VRBGA培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h，挑選典型菌落，分別在各菌相應(yīng)的培養(yǎng)基上反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，至少3次劃線分離后得到純化單菌落，觀察菌落特征，并進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、接觸酶測試、氧化酶測試，具體的實(shí)驗(yàn)方法參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》［15］和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［16］;挑取典型單菌落，于LB液體培養(yǎng)基中30或37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，菌懸液加20%甘油于－80℃冰箱中凍藏［17］，用于進(jìn)一步進(jìn)行16S rDNA基因的提取分析。

1.2.3 16S rDNA分析 將貯藏初期(0 d)、中期(3 d)、后期(6 d)分離純化得到的腐敗菌，經(jīng)過LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，4℃、9000 r/min離心1 min，收集菌體，采用DNA提取試劑盒提取分離純化所得菌株的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通用引物為27f/1492r，參照董文霞等［18］的擴(kuò)增條件，95℃預(yù)變性5 min后持續(xù)變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸30 s;擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)條帶后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司(海南分公司)測序，結(jié)果登陸NCBI網(wǎng)站進(jìn)行同源性分析，采用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌相變化分析 在方法1.2.2中，對貯藏初期、中期、后期的腐敗細(xì)菌進(jìn)行分離純化的過程中，同時(shí)選取菌落數(shù)在30～300(Colony－Forming Units，CFU)的平板，根據(jù)菌落形態(tài)特征并結(jié)合鏡檢，對相同菌落細(xì)菌進(jìn)行分組和歸類計(jì)數(shù)，并計(jì)算同種菌落細(xì)菌占當(dāng)天菌落總數(shù)的比例;再結(jié)合16S rDNA基因分析鑒定結(jié)果，進(jìn)一步分析3個(gè)貯藏時(shí)期的菌相組成及比例變化規(guī)律。

1.2.5 優(yōu)勢腐敗菌致腐能力定量測定

1.2.5.1 優(yōu)勢腐敗菌懸液的制備 將貯藏后期分離純化的2號腐敗希瓦氏菌、5號奧奈達(dá)希瓦氏菌、16號霍氏腸桿菌，3株優(yōu)勢菌活化后，取典型菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，希瓦氏菌與霍氏腸桿菌分別置于30、37℃搖床培養(yǎng)，至菌懸液濃度達(dá)到108CFU/mL，離心12000 r/min、30 min，棄上清，無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL，備用。

1.2.5.2 優(yōu)勢腐敗菌魚肉的制備與測定 參照唐文靜等［19］法制備無菌魚塊。卵形鯧鲹經(jīng)“三去”處理后清洗干凈，用無菌水沖洗，75%乙醇擦拭卵形鯧鲹魚體，用無菌剪刀剪背脊內(nèi)部無污染魚肉，保證魚塊厚度為1 cm左右、45～50 g/塊，制備好的無菌魚塊菌落總數(shù)應(yīng)＜102CFU/g［20］。在超凈工作臺中，將無菌卵形鯧鲹魚塊分為3組，每組3個(gè)平行，放入制好的3種菌懸液中，浸泡30 s，撈出瀝干，裝入無菌的自封袋中置于4℃冰箱中貯藏，每隔2 d取出接種的魚塊進(jìn)行感官評價(jià)、菌落總數(shù)、TVB－N指標(biāo)測定，以未接種菌液的處理作為對照組。

1.2.5.3 測定指標(biāo) 感官評定參照王者等［21］對卵形鯧鲹的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，采用10分制評分法，由10名專業(yè)人士組成的感官評定小組，分別從樣品的色澤、氣味、組織形態(tài)和彈性結(jié)構(gòu)4個(gè)方面綜合評分，結(jié)果取平均值。當(dāng)樣品的評定綜合指標(biāo)在6分以下時(shí)，視為其初期腐敗的開始。

參照GB 4789.2－2016［22］進(jìn)行菌落總數(shù)測定;參照GB 5009.228－2016［23］法測定TVB－N值，參照許振偉等［20］的方法進(jìn)行腐敗能力的定量分析，以腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子(YTVB－N/CFU)為評價(jià)指標(biāo)，計(jì)算公式如下:

公式中:(TVB－N)0、(TVB－N)s分別表示初始點(diǎn)和貨架期終點(diǎn)的TVB－N含量，mg/100 g，N0、Ns分別表示初始點(diǎn)和貨架期終點(diǎn)的菌落總數(shù)，CFU/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)及繪圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;不同優(yōu)勢腐敗菌致腐能力的組間顯著性分析，采用ANOVA進(jìn)行分析，不同小寫字母表示組間差異顯著(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)分析

通過6種選擇培養(yǎng)基稀釋涂布篩選，至少3次以上平板劃線分離，卵形鯧鲹4℃冷藏期間共分離出16種單菌落，分別以阿拉伯?dāng)?shù)字命名，16株腐敗細(xì)菌菌落形態(tài)特征見表1。

表1 16株腐敗細(xì)菌的菌落形態(tài)特征Table1 Colony morphology of 16 putrefying bacteria

表1可知，16株菌的菌落形態(tài)全為圓形;顏色有所不同，大部分為淡黃色，2株為乳白色和2株為深紫色，16號菌株菌落中央深紫色，周邊為淡紫色;15株菌菌落表面都為隆起，只有16號菌株菌落凹陷;菌落大部分為不透明，僅有3種菌落透明(3、4、5號);菌落表面狀態(tài)大多為光滑，只有1和14、15、16號表面粗糙。

2.2 16株腐敗細(xì)菌形態(tài)特征及部分生理生化指標(biāo)測定結(jié)果

表2為分離純化的16株菌革蘭氏染色及其他生理生化特征。

表2 16株腐敗細(xì)菌的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of 16 putrefying bacteria

16株菌中，13株為桿狀，1株為球菌，2株為棒狀;4株菌(10～13號)有芽孢;此外，除2號菌株以外，其他菌株接觸酶實(shí)驗(yàn)陽性，說明這些菌株中均存在過氧化氫酶;3、6、7、10、11、13、14號菌株氧化酶實(shí)驗(yàn)為陽性，其他均為陰性。革蘭氏染色結(jié)果表明，16株菌中有6株是革蘭氏陽性菌，占37.5%，其余10株為革蘭氏陰性菌，占62.5%。

2.3 16S rDNA分析結(jié)果

2.3.1 16菌株P(guān)CR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測結(jié)果 采用27f/1492r通用引物，對冷藏卵形鯧鲹16株腐敗細(xì)菌，進(jìn)行16S全長序列PCR擴(kuò)增，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳圖譜見圖1。

圖1 16株腐敗細(xì)菌的16SrDNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of 16SrDNA genes from 16 putrefying bacteria

圖2 基于16SrDNA序列同源性的16株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16 putrefying bacteria based on 16SrDNA sequences

圖1 顯示，16株菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均得到特異性清晰明亮的條帶，片段大小為1.5 kbp左右，顯示PCR擴(kuò)增成功，樣品純度合格，可以用于后期的測序。

2.3.2 16株菌的16S rDNA基因序列分析 將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測，將檢測得到的16株菌的基因序列與NCBI網(wǎng)站中的基因總庫進(jìn)行對比，選取其中同源性(≥98%)最高的菌株序列，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定優(yōu)勢腐敗菌的種類;結(jié)果見圖2、表3。

由圖2、表3可知，16株菌16SrDNA序列與模式菌株序列的相似度均≥98%，說明鑒定結(jié)果可靠。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后，將16株菌的基因序列提交至GenBank獲得臨時(shí)登錄號，再與NCBI中的基因總庫進(jìn)行比對，結(jié)果16株菌分屬于6個(gè)菌屬，其中5株(菌株編號1、2、3、4、5)屬于希瓦氏菌屬(Shewanella sp.);2株(6、7號)假單胞菌屬(Pseudomonas sp.);8號菌株為不動桿菌屬(Acinetobacte baumanniir)，9號菌株為葡萄球菌屬(Staphylococcus aureus)，4株(10、11、12、13號)屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.);14號植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum);2株(15、16號)腸桿菌屬(Enterobacter sp.)。

表3 冷藏卵形鯧鲹腐敗細(xì)菌的16SrDNA序列分析Table 3 16SrDNA sequence analysis of putrefying bacteria in refrigerated Trachinotus ovatus

研究發(fā)現(xiàn)［24］，魚類腐敗菌的種類受品種、捕獲季節(jié)、貯藏環(huán)境等因素的影響，而有較大的差異，Huang H等［25］發(fā)現(xiàn)，魚類低溫冷藏的主要菌相一般為假單胞菌、腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸菌、不動桿菌、腐敗希瓦氏菌等;一般有氧冷藏動物性產(chǎn)品的腐敗細(xì)菌主要是蛋白分解能力強(qiáng)的嗜冷性革蘭氏陰性菌，包括假 單 胞 菌 屬(Pseudomonas sp.)、希 瓦 氏 菌 屬(Shewanella sp.)和 腸 桿 菌 科(Enterobacteriaceae)等［26］，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

2.4 菌相分析

4℃冷藏卵形鯧鲹貯藏初期(0 d)、中期(3 d)、后期(6 d)的菌相變化見圖3。

圖3 冷藏卵形鯧鲹菌相變化圖Fig.3 Phase changes of refrigerated Trachinotus ovatus

不同的選擇性培養(yǎng)基選擇性分離篩選不同的菌屬。IA選擇性培養(yǎng)基篩選的是產(chǎn)硫細(xì)菌(1～5號菌)，主要是希瓦氏菌屬;CFC篩選的是假單胞菌屬(6～7號菌);PCA培養(yǎng)基為平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(8～9號菌);TSA篩選對營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌(10～13號菌)，主要是芽孢桿菌屬;MRS篩選的是乳酸菌屬(14號菌);VRBGA篩選的是腸桿菌屬(15～16號菌)。

圖3可以看出，6種不同的選擇性培養(yǎng)基篩選得到的菌株數(shù)和比例有所不同，初期(0 d)各菌屬均有分布，1號海藻希瓦氏菌(Shewanella algae 14.1%)、2號腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens 16.8%)、6號綠膿假單胞菌桿菌(Pseudomonas aeruginosa 29.6%)、9號金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 14.8%)占比較高;中期(3 d)時(shí)2號腐敗希瓦氏菌比例上升到30.4%、5號奧奈達(dá)希瓦氏菌比例為21.6%、6號菌株比例下降到17.8%，新出現(xiàn)7號菌株丁香假單胞桿菌(Pseudomonas syringae 13.7%)占比均較高;后期(6 d)篩選到的菌株較少，但比例較高，2號腐敗希瓦氏菌比例達(dá)到最高48%，5號奧奈達(dá)希瓦氏菌26.6%，16號霍氏腸桿菌只在后期出現(xiàn)，占比也較高為19.4%。

從整體上分析，4℃冷藏卵形鯧鲹的菌相構(gòu)成比較復(fù)雜，希瓦氏菌屬種類最多、所占比例最高，其次是假單胞菌屬。貯藏初期菌相豐富，各菌屬均有分布;中期乳酸菌屬消失，除希瓦氏菌屬和假單胞菌屬比例較高以外，其他菌屬占比較小;后期，2株希瓦氏菌占比較高(74.6%)，其次是腸桿菌(19.4%)，其他大部分菌種減少或消失。

年益瑩等［9］測定了用HCl酸化減菌處理，對金鯧魚塊微凍(－3℃)貯藏下菌相變化的影響表明，優(yōu)勢腐敗菌由貯藏初期的希瓦氏菌過渡到中期的希瓦氏菌、環(huán)絲菌及假單胞菌，直到末期的假單胞菌;藍(lán)蔚青等［27］研究發(fā)現(xiàn)銀鯧冷藏初期細(xì)菌多樣性較高，優(yōu)勢菌為葡萄球菌(占44.2%)和假單胞菌(占23.9%)，而希瓦氏菌只占6.4%，貯藏末期的優(yōu)勢菌則由假單胞菌(占45.7%)和希瓦氏菌(占33.6%)構(gòu)成。Lalitha［28］研究了養(yǎng)殖羅氏沼蝦在冰藏過程中的微生物變化，新鮮的羅氏沼蝦中，Enterobacteriaceae和Aeromonadaceae為優(yōu)勢菌;在貯藏末期，40%～52%是H2S產(chǎn)生菌;Dabade等［29］研究了不同冷藏溫度下美菲對蝦(Penaeus notialis)菌相和優(yōu)勢腐敗菌，在28和7℃時(shí)，H2S產(chǎn)生菌占優(yōu)勢，而在0℃時(shí)，假單胞菌占優(yōu)勢;冷藏卵型鯧鲹的菌相變化與文獻(xiàn)報(bào)道類似，優(yōu)勢菌也是假單胞菌、希瓦氏菌，只是菌相組成及比例變化不盡相同，貯藏后期希瓦氏菌占絕對優(yōu)勢，說明水產(chǎn)品種類、貯藏條件對菌相組成及比例都有直接影響。

卵形鯧鲹出現(xiàn)了霍氏腸桿菌和芽孢桿菌等，可能是卵形鯧鲹捕獲后環(huán)境中的腐敗菌附著在水產(chǎn)品上所致。Surendran等［30］研究發(fā)現(xiàn)熱帶魚類腸桿菌含量偏高，鄭振霄等［31］也認(rèn)為冷水魚冷藏過程中，希瓦氏菌屬與腸桿菌屬在腐敗過程中占主導(dǎo)地位。

卵型鯧鲹貯藏初期革蘭氏陰性菌比例為76%，末期上升為97.8%;Lalitha［28］研究了養(yǎng)殖羅氏沼蝦在冰藏過程中的微生物變化，新鮮的羅氏沼蝦中，革蘭氏陰性菌占總菌數(shù)的73%，經(jīng)過19 d的貯藏后，革蘭氏陰性菌占總菌數(shù)的80%，說明冷藏條件下卵形鯧鲹等水產(chǎn)品的營養(yǎng)基質(zhì)更適合革蘭氏陰性菌的生長。

由菌相分析可知，4℃冷藏卵形鯧鲹貯藏末期希瓦氏菌屬(2號腐敗希瓦氏菌屬、5號奧奈達(dá)希瓦氏菌)和16號霍氏腸桿菌3菌株后期所占的比例較大，確定為數(shù)量優(yōu)勢菌，進(jìn)一步進(jìn)行致腐能力的定量測定。

2.5 優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力分析

接種3株優(yōu)勢腐敗菌后，卵形鯧鲹魚塊冷藏期間，分別測定感官、TVB－N值、菌落總數(shù)等指標(biāo)。

2.5.1 感官評價(jià) 接種不同優(yōu)勢腐敗菌后卵型鯧鲹冷藏期間的感官品質(zhì)變化結(jié)果見圖4。

由圖4可知，接種3株優(yōu)勢腐敗菌后的卵形鯧鲹感官分值總體呈下降趨勢，而且變化規(guī)律基本一致，感官分值均低于對照組，新鮮的卵形鯧鲹切面色澤正常，富有光澤，肌肉組織紋理清晰，具有海水魚固有的清香，富有彈性。但是隨著貯藏時(shí)間的加長，冷藏卵形鯧鲹魚體表面的色澤逐漸變暗淡，失去原來的光澤，變軟且失去彈性，散發(fā)著腥臭味，肌肉紋理模糊，品質(zhì)明顯下降，逐漸趨向于腐敗狀態(tài)。到達(dá)第6 d時(shí)，對照組為5.6分＜6分，超過可接受點(diǎn)，6 d時(shí)接種腐敗希瓦氏菌的感官分值為3分，說明已經(jīng)高度腐敗。

圖4 接種不同優(yōu)勢腐敗菌的卵形鯧鲹冷藏期間感官品質(zhì)的變化Fig.4 Sensory quality changes of Trachinotus ovatus inoculated with different dominant spoilage bacteria during chilled storage

2.5.2 菌落總數(shù)變化 菌落總數(shù)(TVC)的變化能夠反映蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝程度，Al－Daqal等［32］規(guī)定水產(chǎn)品可食用的菌落總數(shù)對數(shù)值上限是6.0，超出即為腐敗。接種不同優(yōu)勢腐敗菌后卵型鯧鲹冷藏期間的菌落總數(shù)變化結(jié)果見圖5。

圖5 接種不同優(yōu)勢腐敗菌的卵形鯧鲹冷藏期間TVC值的變化Fig.5 TVC value changes of Trachinotus ovatus inoculated with different dominant spoilage bacteria during chilled storage

圖5 顯示，冷藏卵形鯧鲹接種優(yōu)勢菌后，隨著貯藏時(shí)間的延長，菌落總數(shù)均呈增加趨勢，對照組增加較為緩慢，貯藏第2 d后，除霍氏腸桿菌和對照組外，2株希瓦氏菌的菌落總數(shù)均已超過6.0，在4 d以后，3株菌株TVC的對數(shù)值均超過8.0，6 d時(shí)，腐敗希瓦氏菌的TVC對數(shù)值達(dá)10，隨著卵形鯧鲹魚肉中的營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有機(jī)酸、胺類物質(zhì)代謝產(chǎn)物的積累，抑制了腐敗菌生長［33］，使得4 d后TVC的增加幅度逐漸減慢。

2.5.3 總揮發(fā)性鹽基氮指標(biāo)的測定 TVB－N值是評價(jià)水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)，樣品鮮度分級標(biāo)準(zhǔn)參考GB/T 18108－2019［34］，優(yōu)級品TVB－N≤15 mg/100 g;合格品TVB－N≤30 mg/100 g，超過30 mg/100 g為腐敗。接種不同優(yōu)勢腐敗菌后卵型鯧鲹冷藏期間的總揮發(fā)性鹽基氮值變化結(jié)果見圖6。

圖6 接種不同優(yōu)勢腐敗菌的卵形鯧鲹冷藏期間TVB－N值的變化Fig.6 TVB－N value changes of Trachinotus ovatus inoculated with different dominant spoilage bacteria during chilled storage

圖6 可知，接種5、16號菌株和對照組的TVB－N值總體增加較為緩慢，接種2號腐敗希瓦氏菌增加速度最快，第6 d時(shí)，其TVB－N值高達(dá)49.7 mg/100 g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于5、16號菌株，說明此時(shí)卵形鯧鲹已經(jīng)高度腐敗，與感官評價(jià)結(jié)果比較一致。另外，不同腐敗菌因營養(yǎng)要求不同，代謝也會存在一定差異，因此將菌落總數(shù)與揮發(fā)性鹽基氮相結(jié)合，計(jì)算產(chǎn)量因子Y(TVB－N/CFU)，可以定量表征各優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力。表4是腐敗希瓦氏菌、奧奈達(dá)希瓦氏菌、霍氏腸桿菌接種無菌卵形鯧鲹魚塊后的產(chǎn)量因子測定結(jié)果。

由表4的TVB－N產(chǎn)量因子(YTVB－N)可以確定致腐能力大小排序?yàn)?腐敗希瓦氏菌＞奧奈達(dá)希瓦氏菌＞霍氏腸桿菌;腐敗希瓦氏菌的致腐因子為，值最大，表明其致腐能力最強(qiáng);奧奈達(dá)希瓦氏菌和霍氏腸桿菌致腐因子接近，分別為3.92×10－8、3.11×10－8mg－1TVB－N/CFU，二者無顯著性差異(P＞0.05)，因此將腐敗希瓦氏菌確定為4℃冷藏卵形鯧鲹的優(yōu)勢腐敗菌。腐敗希瓦氏菌產(chǎn)量因子的致腐能力低于冷藏鱸魚片［21］的腐敗希瓦式菌屬致腐能力;遠(yuǎn)高于羅非魚［20］和冷藏鰱魚［35］腐敗希瓦氏菌的致腐能力;腐敗希瓦氏菌致腐能力的不同，可能與水產(chǎn)品的所含營養(yǎng)成分的差異及代謝水平不同有關(guān)。

表4 3種優(yōu)勢腐敗菌的TVB－N產(chǎn)量因子Table 4 TVB－N yield factors of 3 dominant spoilage bacteria

年益瑩等［9］發(fā)現(xiàn)，酸化減菌處理金鯧魚肉塊微凍(－3℃)貯藏末期的優(yōu)勢菌為假單胞菌;張璟晶等［33］發(fā)現(xiàn)市售冰鮮銀鯧的優(yōu)勢腐敗菌是假單胞菌和希瓦氏菌;唐文靜等［19］確定了冷藏海鱸魚的優(yōu)勢腐敗菌為假單胞菌、草莓假單胞菌和腐敗希瓦氏菌;Gill等［36］研究認(rèn)為假單胞菌屬和希瓦氏菌屬是冷鏈流通中高水分蛋白食品的特定腐敗菌，Lone等［37］研究發(fā)現(xiàn)，在不同的貯藏和加工過程中水產(chǎn)品中的特定腐敗菌是不同的，海水魚冷藏過程中的SSO為希瓦氏菌屬，淡水魚冷藏過程中的SSO為假單胞菌屬。如帶魚［38］、牙鲆［39］、鱸魚［21］等水產(chǎn)品的特定腐敗菌均為腐敗希瓦氏菌。

本研究假單胞菌屬在貯藏中期比例較高，后期基本消失，腐敗希瓦氏菌后期占比最高達(dá)48%，且致腐能力又強(qiáng)，成為冷藏卵形鯧鲹的優(yōu)勢腐敗菌。腐敗希瓦氏菌為革蘭氏陰性桿菌，其腐敗活性強(qiáng)，能把氧化三甲胺還原成三甲胺，產(chǎn)生硫化氫等揮發(fā)性氣體［40］，導(dǎo)致水產(chǎn)品出現(xiàn)魚腥惡臭味［5］。并能形成生物被膜使水產(chǎn)品表面發(fā)粘［41］，表現(xiàn)出一系列腐敗特性。腐敗希瓦氏菌等為主的優(yōu)勢腐敗菌數(shù)量及種類，與水產(chǎn)品貨架期也存在顯著關(guān)聯(lián)［42］。因此腐敗希瓦氏菌是導(dǎo)致低溫貯藏水產(chǎn)品發(fā)生腐敗的重要因素之一。

3 結(jié)論

本研究通過菌落形態(tài)、部分生理生化指標(biāo)及16S rDNA分析，從4℃冷藏卵形鯧鲹魚肉中獲得16株腐敗細(xì)菌，分別歸屬于6個(gè)屬，假單胞菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬等大多出現(xiàn)在初期和中期;希瓦氏菌屬種類最多，其中腐敗希瓦氏菌和奧奈達(dá)希瓦氏菌、腸桿菌屬的霍氏腸桿菌在貯藏后期占比較高;對貯藏期后期的3株數(shù)量優(yōu)勢菌進(jìn)行致腐能力定量測定發(fā)現(xiàn)，腐敗希瓦氏菌的致腐能力遠(yuǎn)高于奧奈達(dá)希瓦氏菌和霍氏腸桿菌，最終確定腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)是4℃冷藏卵形鯧鲹的優(yōu)勢腐敗菌;該研究可為后續(xù)靶向抑菌延長冷藏卵形鯧鲹貨架期提供理論參考。