高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和蘆丁

齊紅，于姍姍，李敏，張秋紅

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，濟(jì)南 250102）

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物的干燥全草，夏、秋二季采收，具有清熱解毒，利水消腫，活血止痛等功效，用于肺熱咳喘，腸癰、扁桃體炎，咽喉炎，小便不利等癥，外用可治瘡癤癰腫和毒蛇咬傷等［1］。白花蛇舌草始載于《潮州志》，其花白色，葉似蛇舌。“莖、葉榨汁飲服，治盲腸炎，又可治一切腸病”。產(chǎn)于廣東、香港、廣西、海南、安徽、云南等省區(qū)，多見(jiàn)于水田、田埂和濕潤(rùn)的曠地［2］。白花蛇舌草為民間常用中草藥，廣東、廣西、上海、山東和江蘇等省市（自治區(qū)）的地方標(biāo)準(zhǔn)中有收載，《中國(guó)藥典》2020年版一部收載了17種含白花蛇舌草的復(fù)方制劑［3］。

白花蛇舌草含有環(huán)烯醚萜類(lèi)、三萜類(lèi)、蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、甾醇類(lèi)以及苯丙素類(lèi)等活性成分［4–6］，還含有錫、錳、鋅、鍶、鉻等微量元素［7］?，F(xiàn)代藥理研究已證實(shí)白花蛇舌草可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒［8–9］等作用。目前，白花蛇舌草質(zhì)量控制研究集中在萜類(lèi)成分齊墩果酸、熊果酸［10–13］和對(duì)香豆酸［14–16］的含量測(cè)定，其它成分如蘆丁、槲皮素［17］、去乙酰車(chē)葉草酸甲酯［18］、6-O-對(duì)香豆酰雞屎藤苷甲酯［19］等亦有報(bào)道，但同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和蘆丁還未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)香豆酸為酚酸類(lèi)成分，蘆丁為黃酮類(lèi)成分，兩者均具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用［20］。

筆者在前人研究的基礎(chǔ)上建立了高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和蘆丁含量，該方法準(zhǔn)確度高、分離度好、操作簡(jiǎn)單，并對(duì)12批白花蛇舌草飲片中對(duì)香豆酸和蘆丁的含量進(jìn)行了測(cè)定和比較，為白花蛇舌草飲片的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC–20AT型，二極管陣列檢測(cè)器，LCsolution工作站，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ–600GDV型，昆山市超聲儀器有限公司。

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀有限公司。

電子天平：MS204TS型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多儀器公司。

對(duì)香豆酸對(duì)照品：批號(hào)為112037–201801，以99.3%計(jì)，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

蘆丁對(duì)照品：批號(hào)為100080–201811，以91.7%計(jì)，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

甲醇：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

實(shí)驗(yàn)用其余試劑均為分析純。

白花蛇舌草飲片樣品：均為茜草科植物白花蛇舌草，樣品編號(hào)及來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

1.2 HPLC色譜條件

色 譜 柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm，瑞典N(xiāo)ouryon公司）；流動(dòng)相：甲醇–0.1%磷酸溶液（體積比為30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)：308 nm（對(duì)香豆酸）、353 nm（蘆?。?；流量：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。對(duì)照品溶液色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 308 nm波長(zhǎng)下對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 353 nm波長(zhǎng)下對(duì)照品溶液色譜圖

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取對(duì)香豆酸對(duì)照品10.62 mg、蘆丁對(duì)照品9.09 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，制得對(duì)照品貯備液，取對(duì)香豆酸對(duì)照品貯備溶液1 mL、蘆丁對(duì)照品貯備液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻，即得，對(duì)香豆酸、蘆丁質(zhì)量濃度分別為10.55、41.68μg／mL。

1.4 樣品溶液的制備

取白花蛇舌草粉末（過(guò)3號(hào)篩）約1.0 g，精密稱(chēng)定，至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的考察

以編號(hào)為6的白花蛇舌草樣品為待測(cè)對(duì)象，進(jìn)行了提取溶劑、提取方法和提取時(shí)間的考察。分別選擇甲醇、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液3種提取溶劑對(duì)對(duì)香豆酸和蘆丁進(jìn)行提取，結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑時(shí)，色譜峰峰面積較大，峰形較好，基線平穩(wěn)，故采用甲醇為提取溶劑。

以甲醇為提取溶劑，分別采用超聲法、回流法、索氏提取法對(duì)對(duì)香豆酸和蘆丁進(jìn)行提取，結(jié)果表明，3種提取方法的色譜峰峰面積接近，超聲法操作簡(jiǎn)單，故選用超聲法對(duì)樣品進(jìn)行提取。

考察超聲時(shí)間分別為20、30、60 min時(shí)的提取效果，發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min時(shí)，提取較完全，故選擇超聲時(shí)間為40 min。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描，采集光譜圖，對(duì)香豆酸和蘆丁的光譜圖分別見(jiàn)圖3、圖4。由圖3、圖4可見(jiàn)，對(duì)香豆酸在308 nm處有最大吸收，蘆丁在254、353 nm下均有最大吸收，但在353 nm下蘆丁的基線更平穩(wěn)，因此選擇對(duì)香豆酸、蘆丁的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為308、353 nm

圖3 對(duì)香豆酸光譜圖

圖4 蘆丁光譜圖

2.3 色譜條件的考察

改變色譜條件對(duì)白花蛇舌草樣品溶液進(jìn)行分析，來(lái)考察色譜條件變化對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。色譜條件變化如下：

（1）對(duì)3種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，分別為甲醇–水系統(tǒng)、甲醇–0.1%磷酸溶液系統(tǒng)和乙腈–0.1%磷酸溶液系統(tǒng)，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇–0.1%磷酸溶液（體積比為30∶70）作流動(dòng)相時(shí)，色譜峰的分離效果較好，且基線較為平穩(wěn)。

（2）將流動(dòng)相流量分別設(shè)定為0.8、1.0、1.2 mL／min，當(dāng)流量設(shè)定為1.0 mL／min時(shí)，色譜峰分離效果較好，峰形較好。

（3）柱溫分別設(shè)置為25、30、35 ℃，色譜峰分離效果均較好，為便于操作，柱溫選擇30 ℃。

（4）分別選用SHIMADZU VP–ODS C18（250 mm ×4.6 mm，5.0 μm）型色譜柱和Kromasil 100–5–C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）型色譜柱，色譜峰分離效果均較好。實(shí)驗(yàn)選擇Kromasil 100–5–C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）型色譜柱。

2.4 線性方程、線性范圍與檢出限

用自動(dòng)進(jìn)樣器依次吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μL注入色譜儀，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。用甲醇逐級(jí)稀釋對(duì)照品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以3倍信號(hào)和噪音（S／N）的比值對(duì)應(yīng)的溶液濃度作為方法檢出限。對(duì)香豆酸、蘆丁的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 香豆酸、蘆丁的回歸方程和線性范圍

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取編號(hào)為6的白花蛇舌草樣品，按1.4方法制備樣品溶液，分別于制備完成后第0、2、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，對(duì)香豆酸和蘆丁峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.31%、0.91%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 精密度試驗(yàn)

取編號(hào)為6的白花蛇舌草樣品6份，每份約1.0 g，精密稱(chēng)定，按1.4方法制備樣品溶液，在1.2 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，對(duì)香豆酸和蘆丁的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.60%、1.16%，說(shuō)明該方法精密度較好，能滿(mǎn)足測(cè)定要求。

2.7 回收試驗(yàn)

精密稱(chēng)取編號(hào)為6的白花蛇舌草樣品6份，每份約0.5 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入對(duì)香豆酸對(duì)照品貯備液1 mL、蘆丁對(duì)照品貯備液5 mL，按1.4項(xiàng)下方法制成樣品溶液。在1.2色譜條件下測(cè)定，分別計(jì)算對(duì)香豆酸和蘆丁的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。加標(biāo)樣品溶液色譜圖見(jiàn)圖5、圖6。由表5可知，對(duì)香豆酸和蘆丁平均回收率分別為94.01%、91.05%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.90%、1.45%（n=6），說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表5 對(duì)香豆酸、蘆丁的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

圖5 308 nm波長(zhǎng)下加標(biāo)樣品溶液色譜圖

圖6 353 nm波長(zhǎng)下加標(biāo)樣品溶液色譜圖

2.9 樣品測(cè)定

分別取編號(hào)為1～12的白花蛇舌草粉末各約1.0 g，精密稱(chēng)定，按1.4項(xiàng)下方法制成樣品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，不同產(chǎn)地樣品中對(duì)香豆酸和蘆丁的含量差異較大，其中蘆丁含量均高于對(duì)香豆酸含量。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草中的對(duì)香豆酸和蘆丁兩種化合物含量的方法，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和較好的精密度，簡(jiǎn)便易行，可用于白花蛇舌草藥材的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。

表6 樣品中對(duì)香豆酸、蘆丁含量測(cè)定結(jié)果 mg／g