胰腺癌組織中L1細胞黏附分子和轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達及意義

秦 雯，楊建宇，陳泰文，鄭海平，朱小東

1 廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院 a.病理科，b.腫瘤科，南寧 530199； 2 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胃及腹部腫瘤病區(qū)，南寧 530021； 3 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，南寧 530021

胰腺癌是一種具有高度侵襲性和致命性的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其不良預后主要與較早發(fā)生局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)[1]。自2000年起，我國胰腺癌的年齡標準化死亡率上升速度已居全球第2位[2]。因此，研究胰腺癌的發(fā)生以及促進其轉(zhuǎn)移、復發(fā)的關(guān)鍵因子，對于胰腺癌的治療以及預后改善具有重要意義。L1細胞黏附分子(L1 cell adhesion molecular，L1CAM)是一種分子量為200～220 kDa的跨膜糖蛋白分子，屬于細胞黏附分子免疫球蛋白超家族的一員，在神經(jīng)組織的發(fā)育和再生中發(fā)揮重要作用[3-4]，近年來，L1CAM被發(fā)現(xiàn)表達于許多腫瘤細胞系與腫瘤組織中[5]，且其高表達往往提示患者預后不良[6-7]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)是一種多功能的細胞生長因子，在促進腫瘤血管形成、細胞外基質(zhì)合成、免疫抑制、損傷修復、纖維化[8]和腫瘤[9-13]的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[14]。本研究通過分析胰腺癌組織中L1CAM和TGFβ1表達情況與患者臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系，旨在探討L1CAM和TGFβ1在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月—2018年1月于廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院行手術(shù)切除的胰腺癌患者為研究對象，收集患者的組織學標本(包括癌組織及癌旁組織標本)、臨床及隨訪資料。納入標準：(1)經(jīng)病理學檢查確診為胰腺導管腺癌；(2)術(shù)前均未接受過化療、放療。排除標準：(1)既往惡性腫瘤史、自身免疫性疾病及血液系統(tǒng)疾病；(2)合并嚴重的心、腦、肺、腎等基礎(chǔ)疾?。?3)精神、智力或神經(jīng)功能障礙，無法配合臨床試驗者。

1.2 隨訪方法 自術(shù)后開始隨訪，在門診及住院記錄中收集所有患者的隨訪信息，配合電話隨訪，隨訪截止日期為2021年1月，共隨訪1～36個月，直至患者死亡或隨訪截止。

1.3 免疫組化染色及評分 將石蠟標本連續(xù)切片后置于恒溫烘箱內(nèi)烤片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟和水化后加入檸檬酸緩沖液進行微波修復；3% H2O2浸泡10 min后PBS洗滌3次，滴加山羊血清封閉10 min；滴加一抗(L1CAM、TGFβ1的最佳稀釋濃度分別為1∶200、1∶100)并于4 ℃孵育過夜，以PBS代替一抗為陰性對照。次日，PBS沖洗玻片，滴加二抗于室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，DAB顯色5 min，自來水終止顯色，蘇木素復染；酒精鹽酸溶液分化5 s，自來水中沖洗20 min藍化；無水酒精脫水，中性樹脂封片。隨機選取5個200倍視野，每個視野均進行染色強度計分與陽性百分比計分，根據(jù)陽性細胞所占比例和染色強度綜合判斷L1CAM、TGFβ1的表達情況。(1)根據(jù)細胞染色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；(2)根據(jù)陽性細胞百分數(shù)計分：無陽性細胞為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分，將2項得分結(jié)果相乘：總分≤3分為低表達，>3分為高表達。所有切片結(jié)果均由2名病理科醫(yī)師獨立雙盲下完成結(jié)果判讀。

1.4 倫理學審查 本研究經(jīng)由廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院倫理委員會批準，批號：倫審WM-2019(101)。所有患者均簽署書面知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入胰腺癌患者125例，其中男69例，女56例；年齡46～82歲，平均年齡(62.06±8.27)歲，其中<60歲53例，≥60歲72例。腫瘤直徑≤2 cm 23例，2 cm<腫瘤直徑≤4 cm 85例，腫瘤直徑>4 cm 17例；腫瘤部位：位于胰頭79例，位于胰體尾46例；病理分化程度：低分化49例，中分化55例，高分化21例；TNM分期：I期23例，Ⅱ期50例，Ⅲ期～Ⅳ期52例；有神經(jīng)侵犯54例，無神經(jīng)侵犯71例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例；有脈管內(nèi)癌栓58例，無脈管內(nèi)癌栓67例。

2.2 L1CAM和TGFβ1在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達情況 L1CAM染色和TGFβ1染色均主要分布于細胞質(zhì)，染色呈棕色及棕黃色顆粒樣(圖1、2)。125例胰腺癌組織中94例(75.20%)L1CAM蛋白高表達，31例(24.80%)L1CAM蛋白低表達(含不表達)；癌旁組織中25例(20.00%)L1CAM蛋白高表達，100例(80.00%)L1CAM蛋白低表達(含不表達)。125例胰腺癌組織中102例(81.60%)TGFβ1蛋白高表達，23例(18.40%)TGFβ1蛋白低表達(含不表達)；癌旁組織中29例(23.20%)TGFβ1蛋白高表達，96例(76.80%)TGFβ1蛋白低表達(含不表達)。L1CAM、TGFβ1在胰腺癌組織中表達均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為76.352、85.461，P值均<0.001)。

2.3 L1CAM和TGFβ1表達水平與臨床病理特征的聯(lián)系 根據(jù)L1CAM表達水平分為L1CAM高表達組(n=94)和低表達組(n=31)，2組間腫瘤大小、部位、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；根據(jù)TGFβ1表達水平分為TGFβ1高表達組(n=102)和低表達組(n=23)，2組間腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。

注：a，胰腺癌組織，高表達；b，癌旁組織，不表達。圖2 胰腺癌組織及癌旁組織中TGFβ1的表達情況(免疫組化，×200)

2.4 胰腺癌中L1CAM和TGFβ1蛋白表達的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，胰腺癌組織中L1CAM和TGFβ1共同高表達者87例，共同低表達者16例，L1CAM高表達而TGFβ1低表達者7例，TGFβ1高表達而L1CAM低表達者15例，兩者在胰腺癌中的表達呈正相關(guān)(r=0.492，P<0.001)。

2.5 Cox風險比例模型分析結(jié)果及生存分析 Cox單因素和多因素風險回歸模型分析顯示，患者的生存時間與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯、遠處轉(zhuǎn)移、L1CAM蛋白表達、TGFβ1蛋白表達相關(guān)(P值均<0.05)，其中TNM分期是胰腺癌患者的獨立危險因素(P值均<0.05)(表2)。Kaplan-Meier生存曲線進一步分析顯示，L1CAM或TGFβ1蛋白高表達胰腺癌患者生存時間顯著縮短，差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為54.661、39.597，P值均<0.001，圖3)。

3 討論

CAM是介導細胞間或細胞與細胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的一系列糖蛋白分子，參與細胞的信號傳導與活化、細胞的伸展和移動、腫瘤轉(zhuǎn)移、創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理及病理過程。L1CAM屬于CAM中的免疫球蛋白超家族成員，由1257個氨基酸構(gòu)成，其胞外區(qū)含有6個免疫球蛋白樣區(qū)域(Ig1～6)和5個纖連蛋白Ⅲ(Fibronectin Ⅲ，F(xiàn)NⅢ)樣區(qū)域(Fn1～5)。L1CAM作為黏附分子能增加腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，具體表現(xiàn)為促進腫瘤細胞跨越內(nèi)膜、侵犯基底膜、轉(zhuǎn)移至其他部位，因此在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[15]。研究表明，L1CAM在膠質(zhì)母細胞瘤[16]、腦轉(zhuǎn)移性腫瘤[17]、子宮內(nèi)膜樣腺癌[18]、結(jié)直腸癌[19-20]、肺癌[21]等多種原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤中呈上升趨勢，是有價值的診斷或預后標志物，也可能成為癌癥治療的新靶點[6]。由于L1CAM屬于間質(zhì)標志物，因此其表達水平的升高提示其促腫瘤的作用可能通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而實現(xiàn)。而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化也可看作是一個去分化的過程，與腫瘤干細胞特性的獲得有關(guān)。腫瘤干細胞代表腫瘤細胞中的一小部分，但表現(xiàn)出獨特的自我更新能力，并通過不對稱細胞分裂產(chǎn)生更多有差異的細胞，從而促進腫瘤的異質(zhì)性，是腫瘤發(fā)生以及治療后復發(fā)必不可少的環(huán)節(jié)[22-23]。

TGFβ是一種多功能細胞因子，在哺乳動物中存在3種同源亞型(TGFβ1～3)，其中TGFβ1是表達最豐富的亞型。TGFβ1基因位于染色體19q13.2區(qū)，由7個外顯子組成，被6個較大的內(nèi)含子分隔[14]。機體對TGFβ1的調(diào)控發(fā)生在多個環(huán)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、分泌和細胞外環(huán)境的活化。在腫瘤組織中，TGFβ1可促進血管形成、抑制免疫系統(tǒng)而使腫瘤細胞逃避殺傷、改變腫瘤細胞與周圍細胞的黏附性從而促進其生長和轉(zhuǎn)移[13]。

本研究結(jié)果顯示，75.20%的胰腺癌組織中 L1CAM蛋白高表達，20.00%的癌旁組織中L1CAM蛋白高表達，胰腺癌組織中L1CAM蛋白高表達率顯著高于癌旁組織；81.60%的胰腺癌組織TGFβ1蛋白高表達，23.20%的癌旁組織TGFβ1蛋白高表達，胰腺癌組織中TGFβ1蛋白高表達率顯著高于癌旁組織。Spearman相關(guān)性分析顯示，L1CAM蛋白和TGFβ1蛋白在胰腺癌中的表達呈正相關(guān)，提示在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，二者可能產(chǎn)生協(xié)同作用，二者的表達可能對胰腺癌的進程發(fā)揮著重要的影響。關(guān)于L1CAM和TGFβ1蛋白在腫瘤進展中的協(xié)同作用在結(jié)直腸癌的研究[24]中曾有報道，通過觀察慢性炎癥性腸病發(fā)展為結(jié)直腸癌的病例發(fā)現(xiàn)，在腸道黏膜慢性炎癥時，巨噬細胞顯著富集，且其分泌的細胞因子(如TGFβ1)增加。

表2 Cox風險回歸模型分析胰腺癌患者3年生存情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)直腸活組織檢查的免疫組化顯示，慢性炎癥性腸病患者的腸上皮細胞中有大量L1CAM表達，而正常結(jié)直腸組織中則沒有。在體外實驗中，TGFβ1可上調(diào)大腸上皮細胞系NCM460中L1CAM的表達，從而增強細胞運動性和凋亡抵抗能力。因此，筆者推測在胰腺癌中L1CAM和TGFβ1蛋白也可能通過類似的分子通路產(chǎn)生協(xié)同作用，進而促進胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究分析了L1CAM蛋白、TGFβ1蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，L1CAM蛋白和TGFβ1蛋白表達均與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓和神經(jīng)侵犯有關(guān)，提示二者與胰腺癌患者疾病進展密切相關(guān)，且均可能促進腫瘤細胞的淋巴道轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移。Cox風險回歸模型分析顯示，患者的生存時間與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯、遠處轉(zhuǎn)移、L1CAM蛋白表達、TGFβ1蛋白表達相關(guān)。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，L1CAM蛋白高表達患者或TGFβ1蛋白高表達患者總生存率顯著低于低表達患者，提示L1CAM蛋白和TGFβ1蛋白表達與生存情況密切相關(guān)。L1CAM蛋白和TGFβ1蛋白高表達影響患者生存預后，可能與其促進淋巴道轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)。

綜上所述，L1CAM蛋白和TGFβ1蛋白在人胰腺癌組織內(nèi)高表達，且與淋巴道轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移及預后不良有關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生了重要的影響。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：秦雯負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；楊建宇、陳泰文、鄭海平參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；朱小東負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。