CYP11B2基因-344C/T位點多態(tài)性在云南彝族人群中的分布

彭紅瑜 范志祥 張延潔 舒 芯 張馥麟 龍 莉

醛固酮合成酶(CYP11B2)基因位于8號染色體長臂2區(qū)4帶(8q24.3)，負責編碼的醛固酮合成酶屬于細胞色素P450超家族的一員，位于線粒體內膜，具有18-羥化酶、11β-羥化酶和18-氧化酶活性[1]。CYP11B2是合成醛固酮最后階段的關鍵限速酶，而醛固酮是人體中最重要的鹽皮質激素，是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的重要組成部分[2]。多項研究發(fā)現CYP11B2基因啟動子區(qū)域的-344 C/T(rs1799998)多態(tài)性，2號內含子轉換多態(tài)性，3號外顯子K173R多態(tài)性等突變會影響CYP11B2基因功能，CYP11B2基因啟動子區(qū)域-344C/T多態(tài)性會影響其與轉錄調節(jié)因子SF-1的結合，-344C與SF-1的結合率比-344T高4倍[3～5]。CYP11B2基因-344C/T位點的突變所引發(fā)的醛固酮合成水平失調會導致體內水鈉滯留，與機體多種疾病例如女性子癇、原發(fā)性及繼發(fā)性高血壓、肥胖、腎病等密切相關，CYP11B2基因多態(tài)作為國內外心血管及腎臟疾病中的研究熱門，在多個國家不同民族不同人種中均有數據[6～11]。本研究探討了CYP11B2基因-344C/T位點在云南省少數民族彝族人群中的多態(tài)分布以及與其他民族、國家人群對比的結果是否具有特異性，為研究CYP11B2基因相關疾病的發(fā)病機制奠定基礎。

資料與方法

1.研究對象：本研究樣本均來自云南省昆明市晉寧縣雙河鄉(xiāng)居民，所有入選者均為當地彝族，年齡為7～84歲，無異族通婚史，排除肝臟、腎臟、甲狀腺功能異常，高血壓和其他心血管疾病，最終入選286例，其中男性88例，女性198例。本研究經昆明醫(yī)科大學醫(yī)學倫理學委員會批準，本項研究入選者均已知情并同意。

2.研究方法：取EDTA抗凝處理后的測試者外周血，采用酚-氯仿法提取基因組DNA，置于-20℃?zhèn)溆?。以該DNA樣品作為模板，采用PCR-RFLP技術特異性擴增目的基因片段，上游引物序列如下：5′-CAG GAG GAG ACC CCA TGT GAC-3′，下游引物序列如下：5′-CCT CCA CCC TGT TCA GCC C-3′。使用1.1x T3 Super PCR Mix(北京擎科生物科技 TSE030)，按比例加入模板與引物配制成20μl PCR體系，設置PCR儀循環(huán)條件為：預變性98℃2min；變性98℃15s；退火58℃15s；延伸72℃30s，共進行38個循環(huán)；最后72℃延伸2min，4℃冰箱保存。PCR產物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，有目的條帶的PCR樣品繼續(xù)使用限制性內切酶HaeⅢ(美國Thermo Fisher Scientific公司)酶切，37℃水浴4h，酶切產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并保存結果，使用Image-Lab軟件分析基因型。

3.統(tǒng)計學方法：分別計算CYP11B2基因-344C/T多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率，卡方檢驗檢測哈迪·溫伯格平衡及組間基因型、等位基因頻率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.CYP11B2基因-344C/T位點多態(tài)性：PCR特異性擴增目的產物后，產生了一條長度為537bp的目的片段(圖1)，將擴增出目的片段的PCR產物繼續(xù)酶切，由于HaeⅢ的酶切位點為GGCC，而位于CYP11B2基因啟動子區(qū)域的-344位點(-GGCT)可發(fā)生胸腺嘧啶(T)與胞嘧啶(C)的互換，產生了能被切開的位點，經HaeⅢ內切酶消化后，等位基因T會產生273bp的片段，等位基因C則被切開產生202bp和71bp兩個片段，138bp和126bp為共有片段，故TT基因型的酶切結果為273bp、138bp和126bp 3個片段，CT型會產生273bp、202bp、138bp、126bp和71bp共5個片段，CC型會產生202bp、138bp、126bp和71bp共4個片段，由于71bp片段過小很難被瓊脂糖凝膠電泳檢測到，故膠圖中不展示71bp條帶(圖2)，由此可以清晰地鑒定出所有樣本的基因型。對所有樣品的基因型統(tǒng)計后進行哈迪·溫伯格平衡檢驗(χ2=0.341，P>0.05)。

圖1 CYP11B2基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 CYP11B2基因-344C/T位點基因型多態(tài)性

2.CYP11B2基因-344C/T位點多態(tài)性在云南省彝族人群中的分布：在云南省晉寧縣雙河鄉(xiāng)286例健康彝族人群中，基因型為TT的人數為171，基因型為CT的人數為97，基因型為CC的人數為18，各自的基因型頻率對應59.79%，33.92%及6.29%。通過計算可得T等位基因的頻率為76.75%，C等位基因的頻率為23.25%(表1)，男性和女性等位基因T/C分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 云南省彝族人群中CYP11B2基因-344C/T位點基因型及等位基因頻率[n(%)]

3.CYP11B2基因-344C/T位點多態(tài)性分布與其他人群的比較：云南省彝族人群中CYP11B2基因-344C/T位點的基因型分布與其在我國新疆維吾爾自治區(qū)哈薩克族、維吾爾族人群中的分布略有差異，與福建省、黑龍江省漢族人群比較差異無統(tǒng)計學意義。其中基因型TT在彝族人群中的分布(59.79%)顯著高于哈薩克族(10.75%)與維吾爾族(40.08%)(P<0.05),彝族人群中CT基因型(33.92%)則低于哈薩克族人群(51.47%)(P<0.05)，與維吾爾族人群比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。等位基因T在彝族人群中的分布(77.27%)明顯高于哈薩克族(36.48%)和維吾爾族人群(61.71%)，等位基因C的頻率分布則較低(P<0.05)，詳見表2。

表2 CYP11B2基因-344C/T位點多態(tài)性在云南省彝族與其他人群中的分布[n(%)]

通過比較彝族與不同國家、不同種族的人群得出以下差異，例如彝族人群中CYP11B2基因-344C/T位點TT基因型(59.79%)顯著高于韓國人(44.03%)、土耳其人(19.17%)、法國白人(31.15%)、意大利白人(33.98%)、德國白人(22.7%)、印度白人(28.43%)與非洲突尼斯黑人(11.49%)(P<0.05)。而彝族人群中基因型CT頻率(33.92%)則較韓國人(47.76%)、土耳其人(57.5%)、法國白人(51.42%)、意大利白人(50.94%)及印度白人(49.49%)較低(P<0.05),與德國白人(43.56%)及非洲突尼斯黑人(40.77%)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。基因型CC頻率在彝族與韓國人群中較低，且兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，彝族人群中基因型CC的頻率(6.29%)顯著低于土耳其人(23.33%)、法國白人(17.43%)、意大利白人(15.08%)、德國白人(33.74%)、印度白人(22.08%)及非洲突尼斯黑人(47.75%)(P<0.05)。比較等位基因T/C的分布頻率可知，在彝族人群和韓國人群中等位基因T/C的分布頻率較為接近(P>0.05),在土耳其人、法國白人、意大利白人、德國白人、印度白人及非洲突尼斯黑人中，等位基因T的頻率較低，等位基因C的頻率較高(P<0.01),詳見表2。

討 論

醛固酮主要作用于腎臟，是人體調節(jié)血容量的重要激素，通過調節(jié)腎臟對Na+的重吸收，維持水鹽平衡。當細胞外液容量下降時，刺激腎小球旁細胞分泌腎素，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，醛固酮分泌增加，使腎臟重吸收Na+增加，進而引起水重吸收增加。近年來，作為醛固酮合成系統(tǒng)的關鍵基因，CYP11B2基因成為心血管疾病和腎功能異常的研究熱點。在土耳其居民中的一項研究發(fā)現，CYP11B2基因的多態(tài)性可能與當地居民的慢性腎病有關，在以韓國年輕人為調查對象的研究中也發(fā)現了CYP11B2基因與末期腎病的相關性[11，12]。另外，CYP11B2基因與疾病的相關性表現出民族和種族差異。周春龍等[6]研究發(fā)現CYP11B2基因與深圳地區(qū)漢族原發(fā)性高血壓相關，而趙平等[13]研究發(fā)現CYP11B2基因與我國錫林郭勒市蒙古族的原發(fā)性高血壓不相關。CYP11B2基因-344C/T位點多態(tài)性與東亞和南亞人群中腦卒中易感性表現出相關，但在高加索白人中差異無統(tǒng)計學意義，而在有關IgA腎病的研究中發(fā)現，CYP11B2基因-344C/T位點多態(tài)性的分布在中國黃種人中差異無統(tǒng)計學意義，卻影響高加索白人的患病風險[14～16]。

關于彝族人群中醛固酮相關疾病方面研究較少，徐洪呂等[17]研究證實彝族人健康成年人群中超重和肥胖率在我國處于中等水平，存在一定的健康隱患。同處云南省的南澗、漾溟和建水3個行政縣內的彝族人群高血壓發(fā)生率不同，建水縣最高，屬于高血壓高發(fā)人群，本研究涉及到的晉寧縣彝族人群則無相關研究數據[18]。

眾所周知,疾病的發(fā)生可能受到遺傳與環(huán)境因素的雙重作用，大多數疾病是多種基因共同參與調控的結果，所以在不同的遺傳背景下，同一疾病的易感基因可能會根據社會背景、民族及種族差異而發(fā)生改變，這些多樣化的結果可以更好地幫助了解基因突變所產生的多態(tài)性對機體或好或壞的影響，以便提前采取應對措施。已有研究證實彝族的一些基因多態(tài)分布具有民族特異性，例如CR1基因的Exon22(rs2274567),Intron27(rs11118133)和Exon33(rs3811381)位點，t-PA基因Alu重復序列I/D等[19～21]。

本研究CYP11B2基因-344C/T位點的多態(tài)性在云南省彝族人群中的分布以及與國內外不同民族、人種的比較發(fā)現，在彝族人群中TT基因型的分布頻率較高，等位基因T頻率也顯著較高，而CT及CC基因型頻率較低，對應的等位基因C的分布頻率也較低。與同屬中國少數民族的新疆維吾爾自治區(qū)哈薩克族與維吾爾族比較，彝族CYP11B2基因-344C/T多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義，揭示了該位點多態(tài)性分布的民族差異。在與土耳其、法國、意大利、德國、印度、非洲突尼斯等不同國家的白人或黑人人群比較發(fā)現，彝族CYP11B2基因-344C/T多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義，說明不同人種之間該位點多態(tài)性分布也不相同[5,10～12,22,23]。該發(fā)現從分子流行病學角度驗證了CYP11B2基因-344C/T位點多態(tài)性在彝族人群中的民族特異性，為云南地區(qū)彝族人群心血管、腎臟疾病等CYP11B2基因相關疾病的研究提供了數據，今后還將在不同疾病中繼續(xù)探索CYP11B2基因不同突變位點的多態(tài)性與各人群之間的關系，為相關地區(qū)疾病防治提供新的思路。