黃芪甲苷對(duì)急性髓系白血病HL60 細(xì)胞系增殖和凋亡的影響

楊 紅 ， 賈 偉 ， 康 佳 ， 周云花 ， 楊寧愛(ài) ， 康宇婷 ， 蘇雅靜 ，喬 霞 ， 汪澎濤 ， 趙志軍

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004）

急性髓系白血病是成人最常見(jiàn)的急性白血病[1]，屬于造血系統(tǒng)惡性腫瘤。黃芪甲苷是從中藥黃芪中提取出來(lái)的一種高純度藥物，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善心肺功能、提高機(jī)體抗病能力等作用[2-3]。近年來(lái)，有研究[4-9]報(bào)道，黃芪甲苷對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制腫瘤侵襲和遷移等作用。黃芪甲苷對(duì)急性髓系白血病HL60 細(xì)胞的作用尚不清楚，因此本研究以急性髓系白血病HL60 細(xì)胞為模型，觀察黃芪甲苷對(duì)其增殖和凋亡的影響，以期為臨床用黃芪甲苷治療急性髓系白血病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人急性髓系白血病HL60 細(xì)胞，購(gòu)買(mǎi)于上海名勁生物科技有限公司，起始來(lái)源ATCC，已進(jìn)行STR 鑒定。黃芪甲苷購(gòu)買(mǎi)于成都普瑞法生物科技有限公司（批號(hào)：84687-43-4，HPLC：98%，規(guī)格：250 mg），避光保存。配制方法：實(shí)驗(yàn)前將黃芪甲苷溶于 DMSO 中，使其濃度為 25 mmol·L-1，臨用時(shí)用含血清培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，使DMSO 濃度＜0.1%。IMDM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液購(gòu)于上海BasalMedia 公司；胎牛血清購(gòu)于以色列BI 公司；青鏈霉素混合液購(gòu)于北京索萊寶公司；Trizol購(gòu)于美國(guó)Ambion 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RR036A）和 Real-Time PCR 試劑盒（批號(hào)：RR820）購(gòu)于日本TaKaRa 公司；BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒、全蛋白檢測(cè)試劑盒和SDS-PAGE 快速凝膠配制試劑盒購(gòu)于凱基生物公司；CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京全式金生物公司；Annexin Ⅴ-APC/7-AAD 凋亡試劑盒（批號(hào)：AP105-60）購(gòu)于聯(lián)科生物公司，Hochest 33258 染色液（批號(hào)：C1018）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗Bax（批號(hào)：A7626）、兔抗 Bcl-2（批號(hào)：A19693）和山羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)：AS014）均購(gòu)于武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；β-actin 一抗（批號(hào)：bs-0061R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Real Time PCR 所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的HL60 細(xì)胞于37 ℃水浴迅速解凍，接種于含20% FBS 和1%青鏈霉素混合液的IMDM 培養(yǎng)液中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 更換1 次培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度增高時(shí)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HL60 細(xì)胞，按 6×104個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于含不同濃度黃芪甲苷（5、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1）的 96 孔板中，每孔 100 μL，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組（只含100 μL 完全培養(yǎng)液）和溶劑對(duì)照組（溶劑濃度與最大濃度藥物組所含溶劑濃度一致），接種后 48 h 加入 10 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 處吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=［（A對(duì)照孔-A實(shí)驗(yàn)孔）（/A對(duì)照孔-A空白孔）］×100%。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HL60 細(xì)胞，按 2×105個(gè)/mL 密度接種于含不同濃度黃芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的24 孔板中，每孔1 mL，同時(shí)設(shè)定溶劑對(duì)照組（同1.2.2 項(xiàng)），每組設(shè)21 個(gè)復(fù)孔，每天從各組取3 孔細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，連續(xù)7 d，繪制HL60 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HL60 細(xì)胞，按 1×105個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于含不同濃度黃芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的6 孔板中，每孔2.5 mL，同時(shí)設(shè)定溶劑對(duì)照組（同 1.2.2 項(xiàng)），每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng) 72 h 后，離心收集細(xì)胞，預(yù)冷 PBS 清洗 2 遍，加入 500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后加入5 μL Annexin Ⅴ-APC和10 μL 7-AAD 輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育15 min 后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 Hochest 33258 染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HL60 細(xì)胞，按 2×105個(gè)/mL 密度接種于含不同濃度黃芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的 24 孔板中，每孔 1 mL，同時(shí)設(shè)定溶劑對(duì)照組（同1.2.2 項(xiàng)），培養(yǎng)72 h后離心收集細(xì)胞，用固定液固定后滴加至載玻片，加入0.5 mL Hochest 332558 染色液避光染色5 min，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化。

1.2.6 Real Time PCR 檢測(cè)細(xì)胞 Bax 和 Bcl-2 mRNA 表達(dá)情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL60 細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于含不同濃度黃芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的 6 孔板中，每孔2.5 mL，同時(shí)設(shè)定溶劑對(duì)照組（同1.2.2 項(xiàng)），培養(yǎng)72 h 后離心收集細(xì)胞，加入Trizol 試劑抽提RNA，按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作合成cDNA，按照TB Green?Premix Ex TaqTMII 操作說(shuō)明進(jìn)行Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系：上游引物、下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，Master Mix 10 μL，RNase Free ddH2O 7 μL，總體積 20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30 s，70 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；65 ℃徹底延伸1 min。Bax 上游引物：5′-ATCAGAACCATCATGGGCTGGACA-3′，下游引物：5′-AGCCCATCTTCTTCCAGATGGTGA-3′；Bcl-2 上游引物：5′-TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTG-3′，下游引物：5′-ACTCACATCACCAAGTGCACCTAC-3′；GAPDH 上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。實(shí)驗(yàn)以 GAPDH 為內(nèi)參，以 2-ΔΔct計(jì)算 Bax 和 Bcl-2 mRNA 表達(dá)量。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞 Bax 和 Bcl-2 蛋白表達(dá)情況 細(xì)胞培養(yǎng)、分組同1.2.4 項(xiàng)，培養(yǎng)72 h后，離心收集細(xì)胞，用全蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞蛋白后按照Western blot 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗（兔抗Bax 和兔抗Bcl-2 以1∶1000 比例稀釋?zhuān)?actin 一抗以 1∶20000 比例稀釋?zhuān)┓跤?、二抗（山羊抗?IgG 二抗以 1∶10000 比例稀釋?zhuān)┓跤捌毓獾炔襟E，結(jié)果用Image J 2.0進(jìn)行灰度掃描及分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)HL60 細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 結(jié)果顯示，經(jīng)黃芪甲苷干預(yù)48 h 后，與對(duì)照組相比，當(dāng)黃芪甲苷濃度≤40 μmol·L-1時(shí)，黃芪甲苷對(duì)HL60 細(xì)胞存活率無(wú)影響；當(dāng)黃芪甲苷濃度>40 μmol·L-1時(shí)，HL60 細(xì)胞存活率出現(xiàn)降低趨勢(shì)，160 μmol·L-1和 320 μmol·L-1時(shí)最為明顯（P 均＜0.01），見(jiàn)圖 1。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇的黃芪甲苷濃度為 10、20、40、80 μmol·L-1。

圖1 黃芪甲苷對(duì)HL60 細(xì)胞存活率的影響

2.2 黃芪甲苷對(duì)HL60 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響

連續(xù)7 d 臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著黃芪甲苷濃度升高，HL60 細(xì)胞增殖能力越弱。培養(yǎng)細(xì)胞至第7 天時(shí)，溶劑對(duì)照組細(xì)胞增殖倍數(shù)達(dá)11.207；含黃芪甲苷終濃度為80 μmol·L-1的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖倍數(shù)僅為 0.310，見(jiàn)圖2。

圖2 黃芪甲苷對(duì)HL60 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響

2.3 黃芪甲苷對(duì)HL60 細(xì)胞凋亡的影響

Hochest 33258 染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HL60 細(xì)胞經(jīng)不同濃度黃芪甲苷干預(yù)后，出現(xiàn)不同程度細(xì)胞核固縮、核碎裂，80 μmol·L-1黃芪甲苷干預(yù)細(xì)胞組最明顯，結(jié)果見(jiàn)圖3A。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HL60 細(xì)胞凋亡比率隨著黃芪甲苷濃度的升高而增高（P＜0.01），見(jiàn)圖3B、圖 C。

圖3 黃芪甲苷對(duì)HL60 細(xì)胞凋亡的影響

2.4 黃芪甲苷對(duì)HL60 細(xì)胞Bax 及Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的影響

Real Time PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HL60 細(xì)胞經(jīng)含 10、20、40、80 μmol·L-1黃芪甲苷濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h 后，Bax mRNA 表達(dá)水平隨黃芪甲苷濃度升高而增高，Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平隨黃芪甲苷濃度升高而降低（P 均＜0.05），見(jiàn)圖4。

2.5 黃芪甲苷對(duì)HL60 細(xì)胞Bax 及 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著黃芪甲苷藥物濃度的升高，Bax 的蛋白表達(dá)量上調(diào)，Bcl-2 的蛋白表達(dá)量下調(diào)（P 均＜0.01），見(jiàn)圖5。

3 討論

近年來(lái)，由于中醫(yī)藥具有標(biāo)本兼治、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)逐漸被各研究者重視，中藥黃芪具有補(bǔ)氣、止汗、利尿消腫、排膿等功效，被廣泛應(yīng)用于急性腎炎、高血壓、糖尿病、缺血性心臟病等疾病的治療[10]。黃芪甲苷是中藥黃芪的有效成分之一，被認(rèn)為是黃芪質(zhì)量的判斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。黃芪甲苷可通過(guò) PI3K/Akt 信號(hào)通路[12-13]、JNK/Nrf2 信號(hào)通路[14]、Wnt/β-catenin 信號(hào)通路[15]、Nrf2/HO-1 信號(hào)通路[16]等多個(gè)作用位點(diǎn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡或降低其侵襲力和遷移力等。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng) 10、20、40、80 μmol·L-1濃度黃芪甲苷干預(yù)72 h 后，HL60 細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞凋亡比率逐漸升高，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮等典型凋亡形態(tài)變化，細(xì)胞凋亡基因Bax 和Bcl-2轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)均發(fā)生了相應(yīng)變化，表明黃芪甲苷可抑制急性髓系白血病HL60 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。有研究[17]通過(guò)MTT 實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷對(duì)HL60 細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作，分析原因可能與其實(shí)驗(yàn)藥物來(lái)源、濃度、干預(yù)時(shí)間、實(shí)驗(yàn)方法等均與本文不同有關(guān)，其中藥物干預(yù)時(shí)間不同的影響可能最大，本文中Real Time PCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)時(shí)間均為72 h，藥物作用時(shí)間更長(zhǎng)。

圖 4 Real time PCR 檢測(cè)Bax 及Bcl-2 mRNA 表達(dá)情況變化

圖5 Western blot 檢測(cè)凋亡比較相關(guān)因子蛋白表達(dá)變化情況

外界環(huán)境和遺傳因素等原因均可引起DNA損害，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，其本質(zhì)是基因病，涉及原癌基因、抑癌基因、DNA 修復(fù)基因、細(xì)胞凋亡等相關(guān)基因的改變，其中，細(xì)胞凋亡是通過(guò)細(xì)胞的主動(dòng)有序死亡使機(jī)體中細(xì)胞數(shù)量保持基本恒定的正常生理過(guò)程，Bax 和Bcl-2 是目前細(xì)胞凋亡研究中功能對(duì)立的最重要一對(duì)細(xì)胞凋亡因子，二者的比率決定細(xì)胞凋亡過(guò)程是否啟動(dòng)[18]。有研究[19]表明，黃芪甲苷作用后可明顯促進(jìn)Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2 的表達(dá)，提高肝癌細(xì)胞HepG 2 凋亡率，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但黃芪甲苷誘導(dǎo)HL60 細(xì)胞凋亡的具體作用及機(jī)制仍需通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行深入探究。

綜上，在體外黃芪甲苷可抑制急性髓系白血病HL60 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，這可能與調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2 凋亡信號(hào)通路有關(guān)。