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    PDGF-BB 基因多態(tài)性與新疆地區(qū)不同民族人群骨關(guān)節(jié)炎易感相關(guān)性研究

    2021-06-22 01:17:20王夢(mèng)雨朱洲均邱貞宇史晨輝王維山
    關(guān)鍵詞:維吾爾族漢族骨關(guān)節(jié)炎

    王夢(mèng)雨,王 超,朱洲均,石 沖,向 偉,王 堆,邱貞宇,史晨輝,王維山*

    1.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨科中心,新疆 石河子 832000;2.石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子832000

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種受生物力學(xué)與生物化學(xué)共同影響的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病,是成年人常見的肌肉骨骼疾病。據(jù)估計(jì),到2040 年將有7 800萬(wàn)人患骨關(guān)節(jié)炎[1],導(dǎo)致殘疾和生活質(zhì)量下降。關(guān)節(jié)疼痛是骨性關(guān)節(jié)炎的明確癥狀,但其病因尚不清楚[2]。OA 的發(fā)生與遺傳、年齡、性別、體重、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷和異常機(jī)械負(fù)荷等因素有關(guān)[3]。OA 病變主要包括關(guān)節(jié)軟骨退變鈣化、滑膜炎癥、骨贅形成、軟骨下囊腫、軟骨下骨重塑、硬化、血管侵襲以及骨軟骨界面滲透性增加[4-5]。OA 與民族、性別、體重、年齡、遺傳、飲食、生活方式及生活環(huán)境等密切相關(guān),不同國(guó)家、地區(qū)、民族其患病率及影響因素均不相同。軟骨下骨血管生成增多,血管突破基底進(jìn)入無(wú)血管軟骨,是骨關(guān)節(jié)炎的診斷特征。Xu 等[6]研究證明來(lái)源于破骨細(xì)胞的PDGF-BB 是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中病理軟骨下骨血管生成的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。

    本研究分析新疆地區(qū)人群原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎(primary knee osteoarthritis,PKOA)的PDGF-BB 基因型,旨在探討新疆地區(qū)漢族、維吾爾族人群基因型頻率分布,為其與原發(fā)性O(shè)A 等相關(guān)的研究提供依據(jù),從基因角度探討原發(fā)性O(shè)A 發(fā)病的遺傳易感因素。

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    隨機(jī)選取2019 年1 月至2020 年11 月石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院、農(nóng)三師醫(yī)院、圖木舒克市人民醫(yī)院PKOA 漢族患者80 例,其中男性28 例,女性52例(年齡48~81 a,平均年齡56.66 a),正常對(duì)照組186 例(年齡41~74 a,平均年齡55.61 a),男性78例,女性108 例;維吾爾族PKOA 患者91 例,其中男性42 例,女性49 例(年齡41~72 a,平均年齡56.82 a),正常對(duì)照組162 例,男性63 例,女性99例(年齡40~78 a,平均年齡54.30 a)。所選取的研究對(duì)象均為長(zhǎng)期生活在新疆地區(qū)的人群。

    1.2 主要儀器與試劑

    PCR 熱循環(huán)儀(Eppendorf Master-cycle gradient,Germany),低溫高速離心機(jī)(HerauesD-37520,Germany),F(xiàn)-90 型多功能暗箱紫外透射儀,DNA 試劑提取盒(北京天根生化公司),瓊脂糖,rs1800817、rs2285094 Pcr 上下游引物。

    1.3 方法

    1.3.1 樣本采集

    住院或在門診取病人的外周血2 ml,存放于EDTA 管中;農(nóng)三師和圖木舒克的樣本根據(jù)病人信息在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢驗(yàn)科中收集。將所收集的樣本放置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

    1.3.2 DNA 的提取

    采用全血DNA 基因提取盒,按照操作步驟提取DNA,將提取出的DNA 至于1.5 ml 凍存管中,并在紫外線分度儀下測(cè)出提取的DNA 濃度,將濃度合格的DNA 樣本至于-20 ℃冰箱中保存。

    1.3.3 引物設(shè)計(jì)

    使用上海生工生物有限公司的軟件設(shè)計(jì)PDGFBB 的rs1800817 位點(diǎn)上游引物CGC TCT TCC TGT CTC TCT GC;下游引物GTT CTC GGG TTC CCA AAG GG。rs2285094 位點(diǎn)的上游引物CCA TGT GCT GAC CAC TTC AT;下游引物GCC ACA TAA CAG GTC TGG CT。

    1.3.4 PCR 擴(kuò)增

    使用移液槍將解凍好的DNA 吸出3 μl、rs2285094 位點(diǎn)上及下游引物各1 μl、PCR mix10μl、無(wú)酶水5 μl 至離心管中組成共20 μl 的反應(yīng)體系(見表1);將PCR 管放入96 孔的梯度PCR 儀里之后再設(shè)定PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件:①預(yù)變性94 ℃5 min②變性94 ℃30 min ③退火62 ℃30 min ④延伸72 ℃27 min ⑤重復(fù)延伸72 ℃5 min ⑥取出反應(yīng)體系標(biāo)記并放入-20 ℃冰箱中備用。用相同的方法進(jìn)行rs1800817 位點(diǎn)DNA 擴(kuò)增。

    表1 PCR 反應(yīng)體系

    1.3.5 凝膠電泳及成像

    用微量加樣槍吸出6 μl DNA maker 加入凝膠的第一個(gè)孔中,再取4 μl DNA 與DNA 上樣緩沖液(loading buffer1 μl)的混合液加入其他凝膠孔內(nèi)并做好記錄。將完成加樣的凝膠平放在水平電泳儀的電泳板上,向電泳板內(nèi)加入TBE 溶液進(jìn)行電泳。電泳參數(shù):電壓100~120 V;電泳時(shí)間:35 min。在電泳結(jié)束后,將電泳凝膠取出放在成像儀內(nèi),通過調(diào)整凝膠塊位置合適后進(jìn)行曝光,將曝光后的圖像保存并記錄。

    1.3.6 DNA 測(cè)序

    將經(jīng)過凝膠電泳過并通過凝膠成像系統(tǒng)確認(rèn)PCR 成功后的DNA 樣本標(biāo)號(hào)記錄,送至博邁德(北京)基因技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行DNA 雙向測(cè)序。

    1.4 統(tǒng)計(jì)分析

    本研究利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)樣本人群的年齡、身高、體重等計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布的資料采用ˉx±s 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述,對(duì)分類資料如性別、是否吸煙、是否飲酒等采用n(%)表示;采用哈迪-溫伯格平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium)方法對(duì)基因位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行檢驗(yàn);對(duì)兩組間計(jì)量資料的比較采用t 檢驗(yàn),對(duì)計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn);應(yīng)用 二分類logistic回歸模型對(duì)患PKOA 的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行分析。其中以P<0.05 作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 研究對(duì)象的基線資料比較

    分別對(duì)新疆地區(qū)的漢族與維吾爾族膝骨性關(guān)節(jié)炎組與非膝骨性關(guān)節(jié)炎組的年齡、身高、體重、BMI、性別、是否抽煙、是否喝酒(見表2)進(jìn)行比較,各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。性別、是否吸煙、是否飲酒、是否從事重體力勞動(dòng)進(jìn)行比較,各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

    表2 一般資料

    2.2 PCR 和基因測(cè)序結(jié)果

    將所提取的漢族PKOA 組和對(duì)照組、維吾爾族PKOA 組和對(duì)照組的DNA 分別加入PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)引物、rs2285094 位點(diǎn)的引物在PCR儀中擴(kuò)增,將擴(kuò)增后的DNA 行2%瓊脂糖凝膠電泳。將擴(kuò)增結(jié)果滿意的DNA 送至北京博邁德基因公司進(jìn)行雙向測(cè)序,分析受試者的 PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)、rs2285094 位點(diǎn)基因型。比較SNP中的rs1800817 位點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)中的rs1800817 位點(diǎn),有GT、GG 兩種基因型;比較SNP 中的rs2285094 位點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)中的rs2285094 位點(diǎn),有CT、CC 兩種基因型。

    2.3 PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)、rs2285094 位點(diǎn)基因多態(tài)性與維吾爾族PKOA 的相關(guān)性

    維吾爾族PKOA 組PDGF-BB 的rs2285094 位點(diǎn)的CC型、CT型分布不同(χ2=17.9,P<0.001),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,PKOA 組PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)的GT 型、GG 型分布不同(χ2=5.08,P<0.05),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3。說(shuō)明維吾爾族攜帶rs2285094和rs1800817 位點(diǎn)的CC 型、CT 型的個(gè)體患原發(fā)性PKOA 有相關(guān)性。

    表3 維吾爾族PKOA 與對(duì)照組的基因型分布

    2.4 PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)、rs2285094 位點(diǎn)基因多態(tài)性與漢族PKOA 的相關(guān)性

    漢族PKOA 組PDGF-BB 的rs2285094 位點(diǎn)的CC型、CT 型分布(χ2=0.001,P=0.98)與非PKOA 組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,PKOA 組PDGF-BB 的rs1800817 位點(diǎn)的GT型、GG 型分布(χ2=4.61,P=0.032)與非PKOA 組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表4。說(shuō)明漢族攜帶rs1800817 位點(diǎn)的CC 型、CT 型的個(gè)體患PKOA 有相關(guān)性;而與攜帶rs2285094 無(wú)相關(guān)性。

    表4 漢族PKOA 與對(duì)照組的基因型分布

    2.5 影響OA 患病率的多因素Logistic 回歸分析

    經(jīng)多因素Logistic 回歸分析,年齡、民族、rs1800817位點(diǎn)、rs2285094 位點(diǎn)基因多態(tài)性是OA 的危險(xiǎn)因素;其中民族是PKOA 的危險(xiǎn)因素,這可能與不同民族間的生活方式及飲食不同有關(guān),性別、BMI、抽煙、飲酒、從事重體力勞動(dòng)不是OA 的危險(xiǎn)因素。見表5。

    表5 影響OA 患病率的多因素Logistic 回歸分析

    3 討論

    OA 是全球最常見的關(guān)節(jié)疾病,60 a 以上的男性約有10%,女性約有18%[5-6]。較大的體重、反復(fù)外傷或手術(shù)聯(lián)合結(jié)構(gòu)、出生時(shí)關(guān)節(jié)異常、痛風(fēng)、糖尿病以及與荷爾蒙相關(guān)的疾病等,已經(jīng)被證明為OA[7-8]的風(fēng)險(xiǎn)增加,其特征是進(jìn)行性退化的關(guān)節(jié)軟骨,軟骨下骨的結(jié)構(gòu)改變,骨贅形成和滑膜炎癥[9-11]。此外,血管生成在組織修復(fù)和骨性關(guān)節(jié)炎的病理生理中起著重要作用[12]。但目前治療骨關(guān)節(jié)炎尚未有有效的疾病調(diào)節(jié)劑,Walsh 和Mapp 等研究表明骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)的血管生成,即從已有的血管中生成新血管,是已知的促進(jìn)OA 進(jìn)展的因素[13-14]。特別是軟骨下異常的骨血管生成導(dǎo)致血管系統(tǒng)入侵骨軟骨連接是人類骨關(guān)節(jié)炎的一個(gè)標(biāo)志[15]。有研究表明PDGF-BB 的基因多樣性與金屬裸支架術(shù)后再狹窄有一定的關(guān)系[16]。Arora-Singh和Gourh 在研究中發(fā)現(xiàn)PDGF-BB 中的rs2285094位點(diǎn)基因多樣性與硬皮病的發(fā)生有一定的相關(guān)性。[17-18]近年來(lái)Su 等[19]在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)PDGFBB 異常增加,誘導(dǎo)軟骨下骨血管生成,促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。

    綜上所述,PDGF-BB 與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。PDGF-BB 基因多樣性與許多疾病都有著密切關(guān)系,但PDGF-BB 基因多樣性與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系以往無(wú)相關(guān)的研究。本實(shí)驗(yàn)通過病例對(duì)照研究,使用卡方檢驗(yàn)、多因素logistic 回歸等方法,分析了PDGFBB的rs1800817位點(diǎn)、rs2285094位點(diǎn)多樣性與新疆地區(qū)漢族和維吾爾族膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果表示,rs1800817 位點(diǎn)基因型分布在漢族和維吾爾族中均有差異(χ2=5.08,P=0.024;χ2=4.61,P=0.032);rs228509 位點(diǎn)基因型分布在漢族中無(wú)差異(χ2=0.01,P=0.98);rs2285094 位點(diǎn)基因型分布在維吾爾族中有明顯差異(χ2=17.79,P=0.00)。通過多因素logistic 回歸分析,年齡是骨性關(guān)節(jié)炎的危險(xiǎn)因素(OR=1.007),民族是骨性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)因素,這可能是維吾爾族與漢族的生活習(xí)慣不同所造成的,這與沈明球等人的流行病學(xué)研究所一致[20]。rs2285094 位點(diǎn)中的CC型和CT 型是骨性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)因素(OR=0.011),這提示rs2285094 位點(diǎn)中的CC 型和CT 型攜帶者可能會(huì)減低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),但該位點(diǎn)的基因型分布在漢族人群中的分布無(wú)差異(χ2=0.01,P=0.98);rs1800817 位點(diǎn)中的GT 型和GG 型是骨性關(guān)節(jié)炎的危險(xiǎn)因素,這提示rs1800817 位點(diǎn)中的GT 型和GG 型攜帶者可能會(huì)增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這可能與本研究樣本量較小有關(guān),限制了相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)功效,存在一定局限性。此外,PDGF-BB基因多態(tài)性對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎易感性可能為原發(fā)性膝骨性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療提供依據(jù),因此有關(guān)結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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