新型99mTC標(biāo)記三苯基磷線粒體膜電位示蹤劑的研究

武香香，朱 鑫，閆 敏，袁 永，李曉芳，王國強(qiáng)，宋軍營，謝治深，張紫娟，胡 鍇，喬永輝，譚曉柯，許段杰，嚴(yán)銀銀，曾華輝，張振強(qiáng)

河南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥科學(xué)院，鄭州450046

線粒體功能障礙廣泛存在于心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、糖尿病、癌癥及退行性疾病等多種疾病中[1]。現(xiàn)已有許多方法用于評估線粒體功能障礙及其功能，如使用分離的線粒體、完整細(xì)胞、原位技術(shù)等[2-3]。分離線粒體分析已廣泛建立，并用于線粒體功能的定量和定性評價(jià)，通常需要大量非細(xì)胞環(huán)境及用于特定目的的適當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件的線粒體樣本。完整細(xì)胞分析能在未受干擾的細(xì)胞環(huán)境中評估線粒體，但經(jīng)常受到滲透性能差的試劑和培養(yǎng)基的限制，導(dǎo)致線粒體不能直接接觸到胞外基質(zhì)和抑制劑及細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用。因此，這些方法在直接研究體內(nèi)線粒體功能障礙及其功能方面有很好的應(yīng)用前景。

線粒體在心肌細(xì)胞(MCM)凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的多步驟過程。線粒體控制的凋亡途徑通常伴隨著線粒體膜通透性改變和線粒體膜電位(ΔΨm)喪失，可以通過膜電位示蹤劑來測量[4]，例如羅丹明-123、3H-四苯基膦(3H-TPP)和99mTc-2-甲氧基異丁基異腈(99mTc-MIBI)，因其優(yōu)先在心肌細(xì)胞中的定位而被用來測定心肌ΔΨm[5-8]。這些親脂性的陽離子能夠被動(dòng)擴(kuò)散到心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，以響應(yīng)大量的細(xì)胞質(zhì)膜負(fù)電位(ΔΨp)和線粒體膜負(fù)電位。然而，羅丹明-123 由于其熒光淬滅很難準(zhǔn)確定量。此外，由于氚具有很長的半衰期(12.43 a)，因此，3H-TPP 僅用作體外探針來測量ΔΨm。99mTc-MIBI 最初是作為心肌灌注單光子發(fā)射斷層掃描(SPECT)示蹤劑開發(fā)的，后來發(fā)展為腫瘤示蹤劑[9]。然而，99mTc-MIBI在肺和肝臟中的高積累量會(huì)干擾心肌血流異常的檢測，故發(fā)展應(yīng)用于臨床的SPECT 敏感膜電位示蹤劑是很有必要的。

最近報(bào)道了一系列18F 標(biāo)記的三苯基磷化合物作為探針，用于評估體內(nèi)/外的ΔΨm[10-12]。我們以前開發(fā)了一種18F 標(biāo)記的三苯基磷酸陽離子([18F]-TPMP)，用PET 對心肌疾病進(jìn)行無創(chuàng)性評估，突出了該探針在闡明線粒體功能障礙的發(fā)病機(jī)制方面的潛力[13]。然而，這些示蹤劑有一定程度的脫氟，造成其放射化學(xué)產(chǎn)率很低。本文報(bào)道99mTc 標(biāo)記的三苯基磷陽離子(99mTc-CHT)作為一種新型膜電位示蹤劑，用于研究嚙齒類動(dòng)物的心肌細(xì)胞膜電位。

1 材料與方法

1.1 材料

Bioscan System 200 薄層色譜(Washington，DC，USA)；配備有UV 檢測器和放射性同位素檢測器的半制備高壓液相色譜系統(tǒng)(HPLC)；放射性活度計(jì)(CRC-15R，Capintec)。

Na99mTcO4是從99Mo-99mTc 發(fā)生器(北京原子高科技有限公司，北京)用生理鹽水洗脫獲得。Sprague-Dawley 大鼠(250 g±10 g)由上海Slac 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 線粒體的藥物攝取實(shí)驗(yàn)

從3 日齡乳鼠中分離提取原代心肌細(xì)胞。采集乳鼠心臟組織并立即浸入DMEM 完全培養(yǎng)基中。心臟組織用D-Hanks 的溶液沖洗兩次，然后用刀片切成小塊。心臟小塊用0.25%胰蛋白酶溶液在37 ℃下溶解30 min，然后用力吸液并通過40 μm 篩網(wǎng)過濾。800 g 離心5 min 后，將顆粒重新懸浮在培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

用99mTc-CHT 或其類似物99mTc-CHB (0.2～2 nmol/L)在DMEM 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞(106個(gè))60 min，用細(xì)胞線粒體分離試劑盒分離MCM 線粒體。簡單地說，從培養(yǎng)皿中收集MCM，并用PBS 洗滌三次，然后重懸在1 mL 線粒體分離液中。細(xì)胞在冰浴中勻漿，800 g 離心10 min。收集沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試管中，11 000 g離心10 min。沉淀作為細(xì)胞線粒體收集，并收集溶液。用γ 探測器對收集到的各成分的放射性進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 電位依賴性攝取

99mTc-CHT 在心肌細(xì)胞中的攝?。孩僭贒MEM 完成培養(yǎng)基中，用99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 孵育MCM。將等分試樣轉(zhuǎn)移到含有胎牛血清的試管中，在不同時(shí)間終止攝取，并離心10 min；②MCM 在不同濃度的99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 緩沖液中培養(yǎng)。60 min 后進(jìn)行攝取測定；③在加入99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的前10 min，將MCM 在鉀鹽緩沖液、CCCP(羰基氰基氯苯腙)和魚藤酮中培養(yǎng)，考察去極化劑對膜電位的影響。在60 min 時(shí)收集細(xì)胞，離心10 min，檢測顆粒和上清液的放射性活性，方法如上所述。

1.4 放射自顯影法

用SD 大鼠(250 g±2 g)進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎制備急性心肌梗死模型。大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎24 h 后解開，隨后使用PET [18F]-FDG 對心肌梗死大鼠模型進(jìn)行評估。模型鼠經(jīng)尾靜脈注射99mTc-CHT(10 mCi)，30 min 后所有大鼠用過量的戊巴比妥處死，收集心臟、洗凈、冰凍切片成1 mm 厚(CM1900，Leica)，然后進(jìn)行15 min 放射自顯影。在儲(chǔ)磷屏系統(tǒng)中(Perkin-Elmer Inc)中進(jìn)行顯影。

2 結(jié)果

成功制備99mTc-CHT 和99mTc-CHB，總放射化學(xué)產(chǎn)率為40.7%～50.1%(n=5，衰變校正)；兩種99mTc標(biāo)記產(chǎn)物的放化純度均大于99%，比活度約為235 Ci/mmol。紙電泳證實(shí)99mTc-CHT 為陽離子，99mTc-CHB 為中性離子。見圖1。

圖1 99mTc/Re-CHT 和99mTc/Re-CHB 的合成過程

99mTc-CHT(32.54%±3.11%)在細(xì)胞內(nèi)的放射性高于99mTc-CHB(28.13%±2.24%)；99mTc-CHT 在細(xì)胞和線粒體中的濃度分別為(2.06%±0.31%) μL-1和(2.82%±0.28%) μL-1。見表1。表明99mTc-CHT 能穿過細(xì)胞膜和線粒體膜。在線粒體中，99mTc-CHT 的放射性含量和濃度(18.84%±2.17%，2.82%·μL-1±0.28%·μL-1)均高于99mTc-CHB(5.06%·μL-1±1.21%·μL-1，0.76%·μL-1±0.09%·μL-1)；99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 加入培養(yǎng)液與細(xì)胞共同孵育60 min 后，細(xì)胞內(nèi)藥物達(dá)到平臺(tái)濃度，分別為37.8%·μL-1±1.3%·μL-1和35.7%·μL-1±1.7%·μL-1。

表1 小鼠心肌細(xì)胞及其線粒體中99mTc 復(fù)合物的放射性劑量，其結(jié)果用于總放射性劑量的占比百分?jǐn)?shù)（%）和濃度（%μL-1）表示

99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 均與鉀離子濃度呈近似平行的反向線性關(guān)系。計(jì)算了99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 回歸曲線的相關(guān)系數(shù)(R2=0.997，0.999)和斜率(-0.24，-0.22)，見圖2。

圖2 99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 細(xì)胞攝取與細(xì)胞外鉀離子濃度的關(guān)系

我們發(fā)現(xiàn)99mTc-CHT(減少81.7%)和99mTc-MIBI(減少76.2%)的細(xì)胞攝取有類似的劑量依賴性。在含有高K+(100 mmol/L)和纈氨霉素(1 μg/mL)的含MCM 培養(yǎng)液中，99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的細(xì)胞攝取量分別下降了81.1%和82.2%，見圖3A。而在含魚藤酮(1 μmol/L)的MCM 培養(yǎng)液中，99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的細(xì)胞攝取量分別降低77.9%和75.9%，見圖3B。

圖3 99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 在小鼠原代心肌細(xì)胞中的時(shí)間依賴性（A）和濃度依賴性（B）積累

CCCP 和魚藤酮存在的條件下，CCCP 的濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、5、100 μmol/L 下99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的細(xì)胞攝取逐漸減少見圖4A。用高濃度K+、纈氨霉素和魚藤酮使膜電位去極化后99mTc-CHT和99mTc-MIBI 的細(xì)胞攝取也明顯減少，見圖4B。

給藥30 min 后，對心肌梗死SD 大鼠心臟冰凍切片進(jìn)行放射自顯影研究。健康心肌的高放射性攝取以及缺血心肌(白箭頭)的極低攝取，見圖4。

圖4 膜電位改變對99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 細(xì)胞攝取的影響

3 討論

環(huán)戊二烯基三羰基99mTC 通過己酰基間隔基與三苯基磷共軛形成放射性示蹤劑99mTc-CHT(見圖1)。即6-溴己酸與過量的二氯亞砜反應(yīng)生成中間體2，然后與二茂鐵在AlCl3存在下進(jìn)行傅-克?；磻?yīng)生成3，然后與三苯基磷在乙腈中反應(yīng)得到4。前體(3 或4)在NH4ReO4/Na99mTcO4，CrCl3和Cr(CO)6存在下進(jìn)行雙配體轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成最終產(chǎn)物Re/99mTc-CHB(7/8)或Re/99mTc-CHT(5/6)。通過質(zhì)譜和核磁共振鑒定所得化合物的結(jié)構(gòu)，與預(yù)測的結(jié)構(gòu)相一致。總放化產(chǎn)率為40.7%～50.1%(n=5，衰變校正)；兩種99mTc 標(biāo)記產(chǎn)物的放化純度均大于99%，比活度約為235 Ci/mmol。紙電泳證實(shí)99mTc-CHT為陽離子，99mTc-CHB 為中性離子。

細(xì)胞和線粒體對示蹤劑的攝取能力通常用ICP-MS 或熒光光譜法檢測。但由于示蹤劑的分離純化過程復(fù)雜，質(zhì)譜分析法可能難以精確測量示蹤劑。熒光示蹤劑很難定量，由于攝取飽和及隨后的猝滅，常常無法檢測到電位的巨大變化。放射性標(biāo)記的磷離子易于定量，且對膜電位的響應(yīng)范圍很大。放射性核素99mTc 也可用來測定細(xì)胞和線粒體中99mTc-CHT 的相對含量。

為了確定99mTc-CHT 是否具有線粒體靶向性，以99mTc-CHB(沒有TPP 基團(tuán))為參照物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各示蹤劑在細(xì)胞和線粒體中的積累有顯著差異，具體數(shù)據(jù)見表1。顯然，99mTc-CHT(32.54%±3.11%)在細(xì)胞內(nèi)的放射性高于99mTc-CHB (28.13% ±2.24%)，表明細(xì)胞中99mTc-CHT 的含量高于99mTc-CHB。99mTc-CHT 在細(xì)胞和線粒體中的濃度分別為(2.06%±0.31%) μL-1和(2.82%±0.28%) μL-1，表明99mTc-CHT 能穿過細(xì)胞膜和線粒體膜。在線粒體中，99mTc-CHT 的放射性含量和濃度(18.84% ±2.17%，2.82%±0.28%)均高于99mTc-CHB(5.06%±1.21%，0.76±0.09%)，表明99mTc-CHT 對線粒體有很強(qiáng)的親和力和靶向性。這表明99mTc-CHT 可以穿過細(xì)胞膜，并在細(xì)胞質(zhì)中積累，然后再進(jìn)入線粒體。相較于99mTc-CHB，心肌細(xì)胞更易被99mTc-CHT滲透，預(yù)示TPP 具有線粒體靶向性并更易積累99mTc-CHT。

參照99mTc-MIBI，我們研究了99mTc-CHT 在小鼠心肌細(xì)胞(MCM)的攝取動(dòng)力學(xué)。圖3A 顯示了99mTc-CHT和99mTc-MIBI 的細(xì)胞攝取成典型的時(shí)間依賴性。99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 加入培養(yǎng)液與細(xì)胞共同孵育60 min 后，細(xì)胞內(nèi)藥物達(dá)到平臺(tái)濃度，分別為37.8%±1.3%和35.7%±1.7%。圖3B 顯示了細(xì)胞攝取率與胞外99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 濃度的關(guān)系。99mTc-CHT和99mTc-MIBI 在細(xì)胞攝取-濃度關(guān)系直方圖上的累計(jì)率無明顯差異。兩種細(xì)胞攝取值在0.05～1 μCi 的濃度范圍內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，但在50 μCi 時(shí)顯著下降。因此，應(yīng)在99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 濃度范圍在0.05～1 μCi 以內(nèi)且孵育60 min 后進(jìn)行攝取測定。

細(xì)胞凋亡線粒體途徑的特點(diǎn)是：線粒體外膜通透性變化前、中、后，線粒體膜電位逐漸下降直至消失。膜電位的改變可以被親脂性陽離子如99mTc-MIBI、3H-TPP 和羅丹明-123 檢測出來，這些物質(zhì)主要集中在線粒體基質(zhì)中，反映正常的線粒體膜電位，反之則表示膜電位異?；蚓€粒體去極化。因此，在兩種條件下，檢測了MCM 攝取99mTc-CHT 作為驅(qū)動(dòng)力的膜電位：①通過改變細(xì)胞外介質(zhì)的鉀離子濃度，可以逐步降低膜電位；②線粒體和血漿膜電位的消失。羰基氰化氯苯腙(CCCP，一種線粒體代謝抑制劑)通過選擇性地消除線粒體內(nèi)膜電位實(shí)現(xiàn)與線粒體的解偶聯(lián)。以魚藤酮(電子轉(zhuǎn)移鏈Ⅰ位點(diǎn)的特異性抑制劑，能誘導(dǎo)線粒體膜電位的消散)作為陽性對照。隨著胞外介質(zhì)中鉀離子濃度的增加，膜電位成比例下降，示蹤劑的電位依賴性攝取也會(huì)隨之降低。因此，在鉀離子濃度逐步增加(從10 到100 mmol/L)的情況下，在MCM 中進(jìn)行攝取測定。圖2顯示了六種鉀濃度下的細(xì)胞相關(guān)活性。99mTc-CHT和99mTc-MIBI 均與鉀離子濃度呈近似平行的反向線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)代表示蹤劑測量膜電位的準(zhǔn)確性?；貧w曲線的斜率表示示蹤劑對電勢梯度變化的敏感性。計(jì)算了99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 回歸曲線的相關(guān)系數(shù)(R2=0.997，0.999)和斜率(-0.24，-0.22)。99mTc-CHT 在靈敏度和準(zhǔn)確度方面的性能與文獻(xiàn)記載的膜電位示蹤劑99mTc-MIBI 幾乎相同。

在CCCP 和魚藤酮存在的條件下，對這些親脂性陽離子進(jìn)行另一項(xiàng)電位依賴性細(xì)胞攝取試驗(yàn)。圖4A 顯示了在CCCP 不同濃度下，99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的細(xì)胞攝取情況，證明細(xì)胞相關(guān)活性呈劑量依賴性降低，對MCM 最有效的CCCP 濃度為10 μmol/L。我們發(fā)現(xiàn)99mTc-CHT(減少81.7%)和99mTc-MIBI(減少76.2%)的細(xì)胞攝取有類似的劑量依賴性。在含有高K+(100 mmol/L)和纈氨霉素(1 μg/mL)的含MCM 培養(yǎng)液中，99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的細(xì)胞攝取量分別下降了81.1%和82.2%(見圖4B)。而在含魚藤酮(1 μmol/L)的MCM 培養(yǎng)液中，99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的細(xì)胞攝取量分別降低77.9%和75.9%(見圖4B)。相比照組，在CCCP(10 μM)、高K+和纈氨霉素、魚藤酮存在下，99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的細(xì)胞攝取量降至6.9%～8.5%，表明線粒體受損嚴(yán)重、線粒體膜電位消散。研究表明，親脂性磷離子攝取中的80%是由線粒體膜電位決定的，約10%是由血漿膜電位決定的。在線粒體膜電位和血漿膜電位同時(shí)崩解的情況下，仍有10%的放射性活性與膜電位無關(guān)，其細(xì)胞結(jié)合活性為非特異性。因此，99mTc-CHT細(xì)胞攝取與膜電位尤為相關(guān)，特別是線粒體膜電位。而且99mTc-CHT 對電位變化的敏感性比99mTc-MIBI稍微強(qiáng)一些。所有這些特征表明，99mTc-CHT可以為檢測線粒體內(nèi)ΔΨm提供一種靈敏的電位示蹤劑。

給藥30min 后，對心肌梗死SD 大鼠心臟冰凍切片進(jìn)行放射自顯影研究。圖5 顯示了健康心肌的高放射性攝取以及缺血心肌(白箭頭)的極低攝取。結(jié)果表明，由于缺血心肌細(xì)胞線粒體膜電位消散，99mTc-CHT 進(jìn)入死亡心肌細(xì)胞難度很大，說明99mTc-CHT通過膜電位依賴的方式或線粒體特異性在心肌細(xì)胞中聚集。綜上所述，我們開發(fā)的99mTc 標(biāo)記三苯基磷陽離子：99mTc-CHT，顯示出三苯基磷陽離子疏水性與其結(jié)構(gòu)中離域電荷的適當(dāng)平衡。它使探針成為一種可在體內(nèi)和體外評估ΔΨm的靈敏線粒體膜電位示蹤劑，其性能與99mTc-MIBI 相當(dāng)或稍優(yōu)越。99mTc-CHT 可以作為潛在的膜電位示蹤劑，應(yīng)用于與線粒體功能障礙相關(guān)的心肌疾病的診斷。

圖5 心肌梗死大鼠心臟切片的放射自顯影圖