納米氧化鋅對玉米幼苗生長及酶活性的影響

趙威 陳先良 王長進 余海兵 黃偉東

摘 要：利用竹葉優(yōu)化合成納米氧化鋅，采用紫外可見吸收光譜法確定納米氧化鋅的最佳合成條件、比色法測定納米氧化鋅對玉米幼苗酶活性影響，并通過電鏡掃描納米氧化鋅的形狀。結(jié)果表明，納米氧化鋅最適合成條件為10mL濾液、1mmol/L Zn（CH3COO）2、pH 6、反應(yīng)溫度60℃，合成的納米氧化鋅為近球形或短桿狀，分散性良好。納米氧化鋅對玉米幼苗生長的影響表現(xiàn)為低濃度促進生長，高濃度抑制生長;低濃度納米氧化鋅能夠為玉米幼苗膜系統(tǒng)提供保護作用;適量添加生物合成的納米氧化鋅能夠促進玉米幼苗生長，提高其抗性。

關(guān)鍵詞：竹葉;納米氧化鋅;玉米幼苗;酶活性

中圖分類號 Q945;TB383 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2021）09-0022-05

與常規(guī)材料相比，納米顆粒具有小尺寸、量子尺寸、宏觀量子隧道及表面等四大效應(yīng)[1-2]。作為21世紀(jì)的新興科技，納米技術(shù)的飛速發(fā)展使納米材料逐漸滲透到人類社會的每個角落。納米氧化鋅作為一種重要的金屬納米顆粒，目前已被廣泛用于電學(xué)、光學(xué)、化學(xué)、生物、食品等領(lǐng)域[3-6]。目前，納米氧化鋅的合成方法主要包括微波輔助等物理途徑[7-8]、液相還原等化學(xué)途徑[9-10]、微生物與植物等生物合成途徑3種[11-15]。與物理、化學(xué)方法相比，生物合成方法（尤其是利用植物組織為原材料）具有易操作、低能耗、避免有毒試劑使用、低成本等優(yōu)點，與當(dāng)前大力倡導(dǎo)的“綠色化學(xué)”理念相吻合。

納米材料對植物生長影響主要表現(xiàn)為正向促進與反向抑制作用，主要取決于納米材料種類、濃度、植物種類等因素。關(guān)于納米氧化鋅對植物的生長影響研究已有報道，但關(guān)于玉米生長的研究卻鮮有報道[16-17]。為此，筆者研究測定生物合成的納米氧化鋅在根數(shù)、根（莖葉）長、根（莖葉）干重、酶活性等方面對玉米幼苗生長的影響，以期為玉米生長調(diào)節(jié)與保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑 竹葉采集于安徽科技學(xué)院東校區(qū);玉米種子（登海618）購于山東登海種業(yè)股份有限公司;Zn（CH3COO）2、HCl、NaOH、Tris、甘油、EDTA、ASA、DTT、GSH、鹽酸、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑、核黃素、愈創(chuàng)木酚、H2O2、Na2HPO4、NaH2PO4購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 主要儀器 HH-8恒溫數(shù)顯水浴鍋（上海汗諾儀器有限公司）;PHS-3C pH計（上海諾萱科學(xué)儀器有限公司）;電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司）;TU-1950紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;S-4800 SEM（日立高新技術(shù)公司）;高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）;光照培養(yǎng)箱（上海皓莊儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物濾液制備 竹葉洗凈晾干，-20℃保存?zhèn)溆?。稱取20g竹葉，加入100mL蒸餾水，95℃水浴加熱30min。植物提取液經(jīng)濾紙過濾2次，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 納米氧化鋅合成 按照體積比為1∶9加入上述濾液與蒸餾水，然后添加一定濃度的Zn（CH3COO）2，控溫反應(yīng)15min，觀察溶液顏色變化。通過調(diào)整濾液體積、

Zn（CH3COO）2濃度、pH及反應(yīng)溫度對其合成過程加以優(yōu)化。

1.3.3 玉米幼苗培養(yǎng) 選取籽粒飽滿、大小均勻的登海618玉米種子置于以50、100、200、400、800?g/mL納米氧化鋅作為培養(yǎng)液的發(fā)芽盒中，以蒸餾水處理作為空白對照，每盒放置100粒玉米種子，隨機排列，重復(fù)3次。培養(yǎng)箱溫度25℃，相對濕度70%，每天光照12h。生長7d后，從經(jīng)過0、50、100、200、400、800?g/mL納米氧化鋅處理的玉米發(fā)芽盒中分別取樣并測定各種指標(biāo)。

1.3.4 生物指標(biāo)測定 玉米幼苗根長、莖葉長和根數(shù)采用測量法;玉米幼苗根鮮重、根干重、莖葉鮮重和莖葉干重采用稱重法。每個處理選取10株幼苗測其根長、莖葉長、根數(shù)、根鮮重、根干重、莖葉鮮重和莖葉干重。

1.3.5 玉米幼苗酶活性測定 稱取0.5g植物樣品，置于預(yù)冷研缽中，加入5.0mL預(yù)冷提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液過濾，并用5mL提取緩沖液沖洗研缽和濾紙，濾液于4℃、4000r/min離心10min，收集上清液，用蒸餾水定容至10mL，低溫保存?zhèn)溆?。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法;過氧化物酶（Peroxidase，POD）測定采用愈創(chuàng)木酚比色法;過氧化氫酶（Catalase）測定采用紫外吸收法[18-19]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的測定采用硫代巴比妥酸（Thiobarbituric Acid，TBA）法[18-19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件，用ANOVA（Analysis of variance，LSD檢驗法）進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米氧化鋅生物合成最適合的條件 稀釋后的濾液加入Zn（CH3COO）2后，溶液由淺綠色變?yōu)辄S色，溶液顏色的改變標(biāo)志著納米氧化鋅的形成（圖1）。此外，紫外可見吸收光譜結(jié)果顯示其最大吸收峰位于393nm，對應(yīng)于納米氧化鋅的表面等離子體共振（圖2）。

2.1.1 濾液體積 不同體積（1～20mL）的竹葉濾液均能合成納米氧化鋅。紫外可見吸收光譜結(jié)果表明，溶液最大吸收峰（A393）隨濾液體積增加呈先增大后減小趨勢，且當(dāng)濾液體積為10mL時達(dá)到最大值（圖3）。因此，確定最佳濾液體積為10mL。

2.1.2 Zn（CH3COO）2濃度 隨著Zn（CH3COO）2濃度的增加，溶液對應(yīng)的最大吸收峰（A393）有升有降，且在1mmol/L時達(dá)到最大值（圖4）。因此，確定最佳Zn（CH3COO）2濃度為1mmol/L。

2.1.3 pH值 溶液酸堿性對納米氧化鋅的合成影響較大，隨著溶液pH值增大，其最大吸收峰（A393）急劇減小，表明酸性條件有利于納米氧化鋅的合成（圖5）。因此，確定最佳pH值為6。

2.1.4 反應(yīng)溫度 由圖6可知，溫度對納米氧化鋅形成的影響非常顯著。紫外可見吸收光譜結(jié)果顯示，溶液最大吸收峰（A393）隨著溫度升高而迅速降低，且當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃時，溶液吸收峰達(dá)到最大值。因此，確定最佳反應(yīng)溫度為60℃。

2.1.5 SEM與EDS分析 納米氧化鋅預(yù)先經(jīng)超聲充分分散，移液器吸取適當(dāng)體積滴加在硅片上，噴金處理后置于掃描電子顯微鏡中檢測。由圖7可知，不同放大倍數(shù)獲取的納米氧化鋅SEM圖像為近球形或短桿狀，存在少許聚集顆粒。而EDS顯示納米氧化鋅在1keV和9keV附近具有明顯的Zn、O元素吸收峰，其余元素如Si、Fe、K等可能歸因于提取液中的成分。

2.2 不同濃度納米氧化鋅對玉米幼苗生物性狀的影響 由圖8可知，隨著納米氧化鋅濃度的增加，玉米幼苗根數(shù)增加，但5個納米氧化鋅濃度間無顯著性差異，其中800?g/mL納米氧化鋅處理的玉米幼苗根數(shù)最多（7根），明顯大于對照;50、100、200、400?g/mL納米氧化鋅處理的玉米幼苗根長與對照無顯著性差異，而100、400、800?g/mL納米氧化鋅的處理的玉米幼苗根長與對照有顯著性差異，其中100?g/mL納米氧化鋅處理玉米幼苗根長最長，說明納米氧化鋅對于幼苗根長具有促進作用，但與其濃度無關(guān);5個處理間玉米幼苗的莖葉長無顯著性差異，但與對照均存在顯著性差異，其中50?g/mL納米氧化鋅處理玉米幼苗莖葉長最大，說明納米氧化鋅濃度<200?g/mL時對幼苗莖葉生長無影響，但>200?g/mL時則明顯抑制玉米幼苗莖葉的生長。

由圖9可知，當(dāng)納米氧化鋅濃度為200?g/mL時，玉米幼苗根鮮重開始低于對照，納米氧化鋅濃度為800?g/mL時幼苗根鮮重最低（4.41g），較對照減少了22.91%;5個處理玉米幼苗根干重顯著小于對照，且5個處理之間也存在顯著性差異，其中濃度為800?g/mL時幼苗根干重最低（1.87g），較對照減少了33.92%。由此可見，納米氧化鋅對玉米幼苗根生長具有抑制作用，且隨著納米氧化鋅濃度的增加，抑制作用越強。

由圖9可知，經(jīng)納米氧化鋅處理后，玉米幼苗莖葉的鮮重和干重均高于對照，并且當(dāng)納米氧化鋅濃度為50?g/mL時，玉米幼苗莖葉的鮮重和干重最大，較對照分別增加35.39%和25.78%。由此可見，納米氧化鋅對玉米幼苗莖葉的生長具有促進作用，并且當(dāng)納米氧化鋅溶液濃度為50?g/mL時對幼苗莖葉生長的促進作用最大。

2.3 不同濃度納米氧化鋅對玉米幼苗抗酶活性與丙二醛含量的影響

2.3.1 幼苗根部 由圖10可知，每個處理間玉米幼苗根部的SOD存在顯著性差異，當(dāng)納米氧化鋅濃度為800?g/mL時幼苗根部SOD活性最大，當(dāng)納米氧化鋅濃度為50?g/mL時幼苗根部SOD活性最小，且與對照無顯著性差異?？傮w而言，幼苗根部SOD活性隨納米氧化鋅濃度增大而增大。POD和CAT能夠清除過量的H2O2，防止膜脂質(zhì)過氧化作用。由圖10可知，玉米幼苗根部POD活性隨著納米氧化鋅濃度的增加呈先增加后減小的趨勢，當(dāng)納米氧化鋅濃度為200?g/mL時POD活性達(dá)最大值，且顯著大于對照。由圖10可知，玉米幼苗根部CAT活性隨著納米氧化鋅濃度的增大而減小，納米氧化鋅濃度為50?g/mL時幼苗根部CAT活性最大，納米氧化鋅濃度為800?g/mL時幼苗根部CAT活性較對照明顯減小，說明當(dāng)納米氧化鋅濃度為800?g/mL時納米氧化鋅對玉米幼苗的CAT起抑制作用。由圖10可知，幼苗根部MDA值隨納米氧化鋅濃度的增加呈先增加后下降的趨勢，當(dāng)納米氧化鋅濃度為400?g/mL時幼苗根部MDA值最大，且與對照無顯著性差異;當(dāng)納米氧化鋅濃度為50?g/mL時幼苗根部MDA值最小，且明顯小于對照，說明當(dāng)納米氧化鋅濃度達(dá)到400?g/mL時會損害玉米根的細(xì)胞膜系統(tǒng)，當(dāng)納米氧化鋅濃度為50?g/mL時對玉米幼苗根的細(xì)胞膜系統(tǒng)具有保護作用。

2.3.2 幼苗莖葉 SOD能夠清除超氧自由基（O2-），與CAT、POD等酶協(xié)同作用來防御活性氧或其他過氧化物自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，從而減少自由基對有機體的毒害。由圖11可知，經(jīng)過不同濃度納米氧化鋅處理后，玉米幼苗莖葉的抗氧化酶表現(xiàn)出不同的變化趨勢。幼苗莖葉的SOD和POD活性隨著納米氧化鋅濃度的增加呈先增加后減小的趨勢，在400?g/mL納米氧化鋅處理下的幼苗莖葉SOD和POD活性最高，且顯著高于對照，其他濃度處理下的幼苗莖葉SOD和POD活性小于對照;CAT的活性隨著納米氧化鋅濃度的增加也呈先增加后減小的趨勢，當(dāng)納米氧化鋅濃度為200?g/mL時CAT活性最大，且明顯大于對照，經(jīng)過納米氧化鋅處理后的幼苗莖葉CAT活性均大于對照;玉米幼苗莖葉的MDA含量隨納米氧化鋅濃度的增加呈先增大后減小趨勢，在200?g/mL納米氧化鋅處理下的MDA含量最大，且顯著大于對照，其他4個處理MDA含量均小于對照，其中50?g/mL納米氧化鋅處理下的MDA含量最小。

3 結(jié)論與討論

本研究首次利用竹葉合成納米氧化鋅，證實竹葉提取液可以充當(dāng)新型反應(yīng)物用于制備納米氧化鋅。以植物組織為原材料的生物合成方法克服了傳統(tǒng)的物理、化學(xué)合成途徑的弊端。通過調(diào)整濾液、Zn（CH3COO）2濃度、pH值以及反應(yīng)溫度，探索出基于竹葉制備納米氧化鋅的最優(yōu)條件。

納米氧化鋅對幼苗的根數(shù)、根長具有促進作用，800?g/mL納米氧化鋅處理下的幼苗根數(shù)最多，而50?g/mL納米氧化鋅處理下幼苗根長達(dá)到最大。但納米氧化鋅對玉米幼苗地上部分影響不大，甚至當(dāng)納米氧化鋅濃度大于200?g/mL時，納米氧化鋅對玉米幼苗地上部分生長還存在抑制作用。Xiang等[16]報道的納米氧化鋅影響大白菜及Singh等[17]報道的納米氧化鋅影響菠菜也得出類似結(jié)論。SOD與CAT、POD等酶協(xié)同作用來防御活性氧或其他過氧化物自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，從而減少自由基對有機體的毒害。本研究中一定濃度的納米氧化鋅對玉米幼苗SOD、POD、MAT的活性具有促進作用，但納米氧化鋅濃度過大會嚴(yán)重降低SOD、POD、MAT的活性，其中200?g/mL是納米氧化鋅最佳濃度，該濃度下幼苗莖葉SOD、POD、MAT的活性均較高，且200?g/mL納米氧化鋅處理下幼苗根莖葉中MDA含量相對較低，說明在200?g/mL納米氧化鋅處理后玉米幼苗的抗氧化性最強。

此外，竹葉提取液中一些活性物質(zhì)具備一定的消炎抗菌作用，以其為原材料合成納米顆粒在抑制病原細(xì)菌、病原真菌等方面具有一定應(yīng)用潛力。

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（責(zé)編：徐世紅）