蒼附導(dǎo)痰丸上調(diào)TNF-α并激活P65和JNK改善多囊卵巢綜合征的研究

★ 駱世存 黃長(zhǎng)盛 凌靜 彭小鵬 張玲玲 吳惠君（.深圳市中醫(yī)院婦產(chǎn)科 廣東 深圳58033；.華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院/深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院 廣東 深圳 5805）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種常見(jiàn)的復(fù)雜異質(zhì)性內(nèi)分泌疾病，育齡婦女發(fā)病率大約為5 %～10 %［1］。根據(jù)2003年修訂的PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)專(zhuān)家共識(shí)，同時(shí)存在稀發(fā)排卵或無(wú)排卵，雄激素過(guò)多癥和多囊卵巢形態(tài)三個(gè)特征中的兩個(gè)，同時(shí)排除其它病因即可診斷為PCOS［2］。PCOS可出現(xiàn)月經(jīng)功能障礙、肥胖、痤瘡、多毛癥和代謝綜合征，但其潛在機(jī)制尚未明確［3-4］。目前已證實(shí)口服避孕藥（OCP）、克羅米芬檸檬酸鹽（CC）和二甲雙胍等藥物可治療月經(jīng)不調(diào)、誘導(dǎo)排卵并調(diào)節(jié)高雄激素血癥［5］。但OCP對(duì)部分患PCOS的女性有禁忌癥，CC雖可有效誘導(dǎo)排卵但懷孕率非常低，而二甲雙胍也會(huì)引起胃腸道疾病等不良反應(yīng)，因此尋找治療PCOS的替代藥物迫在眉睫［6］。目前中藥逐漸在PCOS治療中發(fā)揮重要作用，研究表明吳麗麗等自擬溫經(jīng)消瘕湯可降低PCOS患者的胰島素抵抗程度［7］；陳氏育卵湯能改善PCOS患者高雄激素狀態(tài)，促進(jìn)卵泡發(fā)育［8］；補(bǔ)腎化痰活血方聯(lián)合針灸能明顯改善PCOS不孕患者子宮內(nèi)膜容受性，提高妊娠率［9］。蒼附導(dǎo)痰丸（CFDT）是一種中國(guó)傳統(tǒng)的中藥配方，已證明可有效緩解PCOS患者癥狀，如增加排卵率、減輕肥胖、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌紊亂等，從而改善PCOS患者的妊娠結(jié)局［10］。但目前對(duì)其分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究仍然十分有限。PCOS患者長(zhǎng)期處于一種慢性炎癥狀態(tài)，患者體內(nèi)腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子水平升高，同時(shí)炎癥相關(guān)信號(hào)通路核因子κB（NFκ-B）轉(zhuǎn)錄因子p65和N-末端激酶（JNK）蛋白激酶被激活［11-13］。在本研究中，我們旨在探討TNF-α水平升高，NFκB通路中p65和JNK的失調(diào)是否參與PCOS致病機(jī)制，并評(píng)價(jià)CFDT在大鼠PCOS模型中的療效。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 研究納入40只6周齡SPF雌性SD大鼠（購(gòu)自中國(guó)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），在喂食一周后隨機(jī)分成4組（每組10只），分別為：正常對(duì)照組，PCOS模型組（PCOS），PCOS+CFDT實(shí)驗(yàn)組（PCOS+CFDT），PCOS+克羅米芬檸檬酸鹽陽(yáng)性對(duì)照組（PCOS+CC）。

1.2 PCOS大鼠模型的構(gòu)建和干預(yù) 將納入的6周齡SPF雌性SD大鼠皮下注射脫氫表雄酮（30 mg/kg/d）和0.2 mL注射用油劑，隨后持續(xù)4周對(duì)大鼠皮下注射胰島素（2 IU/d）（諾和靈，美國(guó)）構(gòu)建PCOS模型。PCOS模型組：造模后第1～14 d給予生理鹽水；PCOS+CFDT實(shí)驗(yàn)組，造模后第1～14 d灌胃蒼附導(dǎo)痰丸水提濃縮液24g/kg/d；PCOS+CC陽(yáng)性對(duì)照組：造模后第1～14 d灌胃克羅米芬懸液20 mg/kg/d。蒼附導(dǎo)痰丸（CFDT）加減配方（中國(guó)中藥深圳市中醫(yī)院制劑中心中藥實(shí)驗(yàn)室）：蒼術(shù)10 g、香附10 g、制半夏10 g、橘紅10 g、白茯苓15 g、炙甘草10 g、菟絲子15 g、柴胡10 g、白芍10 g、生地20 g、川芎10 g、黃芪20 g、黃芩10 g等十三味中藥組成，水提2次，濃縮，含生藥2.5 g/mL，4 ℃保存。

1.3 指標(biāo)觀察

1.3.1 體重和性激素水平測(cè)量 藥物處理后第14 d記錄大鼠體重，然后腹膜內(nèi)注射0.3 mL 2%戊巴比妥麻醉大鼠，收集血液。以3 000 rpm的速度離心20 min后，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（Adlitteram Diagnostic Laboratories，CA，USA） 測(cè)量睪酮（T）和雌二醇（E2）的血清水平，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.2 卵巢形態(tài) 解剖卵巢組織并在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中洗滌，制備石蠟包埋切片，用10%多聚甲醛固定5 h后，將切片脫水并包埋在石蠟中并用蘇木精和伊紅染色，脫水、透明、封片后用顯微鏡下評(píng)估卵巢形態(tài)。

1.3.3 免疫組化（IHC） 用10%多聚甲醛固定包埋切片并用1%Triton X-100透明化。用PBS洗滌兩次后，在4℃下分別與TNF-α抗體（SC-52746，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），TNF R1抗 體（SC-8436，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），TNF R2抗體（SC-8041，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），p-p65抗 體（SC-136548，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），p65 抗體（CST-8242，Santa Cruz，CA，USA ，1∶50） ，JNK 抗 體（SC-7345，Cell Signal Technology，MS，USA，1∶200） 和 p-JNK 抗 體（SC-135642，Santa Cruz，CA，USA，1∶100） 孵育過(guò)夜。洗滌兩次后，將切片與二抗一起孵育1 h后，用3,3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色并在顯微鏡下測(cè)定這些蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CFDT改善大鼠模型的PCOS綜合征 給藥前，各組PCOS大鼠體重?zé)o顯著差異，且均高于正常對(duì)照組（對(duì)照組），提示PCOS造模成功。給藥后，與PCOS模型組相比，PCOS+CFDT和PCOS+CC中大鼠體重顯著降低（圖1A）。HE染色結(jié)果顯示，正常組卵巢組織結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)完整，卵泡中有多個(gè)顆粒細(xì)胞，有卵母細(xì)胞和輻射冠。相反，PCOS組的卵巢組織紊亂，白膜表面增厚，組織中有不同階段的卵泡，包括閉鎖卵泡和囊性擴(kuò)張的卵泡。卵泡中顆粒細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，卵泡和輻射冠中沒(méi)有卵母細(xì)胞。 PCOS + CFDT和PCOS + CC組大鼠卵巢組織的結(jié)構(gòu)和形態(tài)無(wú)明顯異常（圖1B）。與正常組相比，PCOS模型組血清睪酮（T）和雌二醇（E2）水平顯著上調(diào)，而PCOS + CFDT和PCOS + CC組的血清T和E2水平低于PCOS組（圖1C-D）。

圖1 CFDT對(duì)體重，卵巢形態(tài)和性激素的影響。

2.2 CFDT可逆轉(zhuǎn)PCOS大鼠TNF-α，TNF R1和TNF R2的表達(dá) IHC結(jié)果提示，與正常大鼠卵巢組織相比，PCOS模型組的卵巢組織中TNF-α，TNF R1和TNF R2的表達(dá)水平顯著上調(diào)。與PCOS組相比，PCOS+CFDT和PCOS+CC組卵巢組織中TNF-α，TNF R1和TNF R2的表達(dá)水平顯著下調(diào)，且與正常大鼠的水平無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖2。

圖2 各組TNF-α，TNFR1和TNFR2表達(dá)水平

2.3 CFDT抑制PCOS大鼠p65和JNK的活化 與正常組的卵巢組織相比，PCOS模型組卵巢組織中p-p65和p65的表達(dá)顯著上調(diào)。而PCOS + CFDT和PCOS + CC組大鼠卵巢組織中p-p65和P65的表達(dá)水平顯著低于PCOS模型組，并與正常組蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3。此外，與正常組相比，PCOS模型組卵巢組織中p-JNK的表達(dá)上調(diào)。與PCOS模型組大鼠相比，PCOS+CFDT和PCOS+CC組大鼠卵巢組織中p-JNK的表達(dá)水平顯著下調(diào)，與正常組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組間JNK總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。

圖3 各組p65，p-p65，JNK和p-JNK表達(dá)水平

3 討論

本研究證實(shí)了CFDT可改善卵巢形態(tài)，并發(fā)揮了類(lèi)似CC的療效，可下調(diào)性激素水平，在CFDT和CC處理的PCOS大鼠中高表達(dá)的TNF-α及兩個(gè)下游受體TNFR1和TNFR2表達(dá)水平顯著降低。PCOS模型大鼠中p65和p-p65高表達(dá)，而CFDT和CC處理可抑制其表達(dá)。同時(shí)PCOS大鼠中p-JNK明顯升高，而各組間JNK無(wú)明顯變化，提示PCOS大鼠模型中，p65和JNK的激活與CFDT丸的作用有關(guān)。

CC用于PCOS患者在無(wú)排卵PCOS中誘導(dǎo)排卵，經(jīng)濟(jì)成本低，不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)也較低。然而，大約15 %～40 %PCOS患者對(duì)CC沒(méi)有治療反應(yīng)，CC對(duì)妊娠結(jié)局的影響仍然不能令人滿意［14］。中藥可為PCOS女性提供替代療法。有研究表明CFDT對(duì)PCOS治療有益，這也在本研究中被證實(shí)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，CFDT可減輕體重，減少顆粒細(xì)胞減少和卵巢功能紊亂，并逆轉(zhuǎn)PCOS大鼠失調(diào)的T和E2激素，避免機(jī)體出現(xiàn)胰島素抵抗和其它PCOS樣表現(xiàn)［15-16］。除此之外，通過(guò)使用CC作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)一步驗(yàn)證CFDT在改善體重、卵巢形態(tài)和性激素方面具有與CC相同的效果。這些發(fā)現(xiàn)表明CFDT可能減輕了PCOS大鼠肥胖及排卵功能障礙，并可作為對(duì)CC沒(méi)有反應(yīng)的PCOS女性的替代療法。

PCOS的確切病因尚不清楚，遺傳和環(huán)境特征被認(rèn)為是相關(guān)的影響因素［17］。一項(xiàng)研究表明，PCOS表現(xiàn)為低度促炎狀態(tài)，外周循環(huán)測(cè)定顯示一組細(xì)胞因子，包括TNF-α、一種已知的胰島素抵抗的促炎介質(zhì)均在PCOS女性中升高［18］。此外，先前的研究表明TNF-α誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)將直接上調(diào)卵巢卵泡膜細(xì)胞類(lèi)固醇生成酶，促進(jìn)多囊卵巢中雄激素的產(chǎn)生［19］。

P65是核因子 κB（NF-κB）的亞基，可被TNF-α磷酸化。在某些情況下，p65的激活與JNK的磷酸化有關(guān)［20］。據(jù)報(bào)道，正常和超重PCOS患者的NF-κB通路中p65表達(dá)均高于沒(méi)有PCOS的患者［21］。p65可能促進(jìn)TNF-α從循環(huán)的單核細(xì)胞中釋放，并導(dǎo)致進(jìn)一步引發(fā)炎癥和胰島素抵抗。本研究觀察到CFDT可降低PCOS大鼠體重、下調(diào)TNF-α水平和升高TNF-α受體的表達(dá)。此外，還觀察到p65，p-p65和JNK的上調(diào)表達(dá)可被CFDT部分逆轉(zhuǎn)。本研究中應(yīng)用CFDT治療可恢復(fù)可能由TNF-α誘導(dǎo)的p65和JNK的激活導(dǎo)致體重和性激素的上調(diào)，該結(jié)果提示TNF-α的上調(diào)和p65和JNK的激活與PCOS等有效治療有關(guān)，

綜上所述，CFDT可發(fā)揮與CC一致的對(duì)PCOS大鼠的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與NF-κB p65和JNK的激活有關(guān)。