10 種廣東藥食兩用植物的抗氧化和抗增殖活性評(píng)價(jià)

萬紅霞，胡玉玫，賈 強(qiáng),*，歐陽歡，薛佩芳

（1.廣州城市職業(yè)學(xué)院食品系，廣東廣州 510405；2.韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005）

“藥食同源”指食物和藥物同出一源，在性能上有相通之處，既有藥物的作用，亦可當(dāng)作食物來起到果腹的作用[1-2]?！八幨惩础笔俏覈鴤鹘y(tǒng)醫(yī)藥寶庫中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，是近十幾年內(nèi)國際關(guān)注的熱點(diǎn)之一，從“藥食同源”到“藥食兩用”是國際健康發(fā)展大趨勢(shì)。藥食兩用植物具有寒熱溫涼四氣與酸苦甘辛咸五味的屬性[3-4]，使用時(shí)根據(jù)四季變化和人體所處的狀態(tài)選擇適宜對(duì)象，使人體存在的病理狀態(tài)恢復(fù)至正常狀態(tài)[5-6]。藥食兩者使用的原理基本相同，所異者：“食養(yǎng)正氣，藥攻邪氣”。俗語說“民以食為天”“藥補(bǔ)不如食補(bǔ)”，通過食補(bǔ)來替代藥物治療，是最理想的養(yǎng)生之道，真正發(fā)揮藥食兩用植物調(diào)節(jié)機(jī)體保健功能預(yù)防疾病的功效[7]。

現(xiàn)代流行病學(xué)研究充分證明，人體內(nèi)過剩的活性氧和自由基與多種慢性退行性疾病及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]，攝入和補(bǔ)充抗氧化劑是預(yù)防這些疾病的一種有效途徑[10-11]。因此，天然抗氧化劑一直是營養(yǎng)與保健食品研究的熱門領(lǐng)域之一，藥食兩用植物是一種重要的天然抗氧化劑來源。藥食兩用植物因含有種類多樣和含量豐富的酚類物質(zhì)，這些酚類物質(zhì)可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，緩解細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)從而達(dá)到抗氧化的功效[12-14]。在中醫(yī)對(duì)腫瘤的治療中，可以通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA 和RNA 合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化周期失控，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有毒性作用等途徑殺滅腫瘤細(xì)胞[15-17]。清熱解毒是中醫(yī)治療腫瘤的大法之一[18-19]。藥食兩用植物多數(shù)為具有苦寒特性的中草藥，具有“清熱解毒”功效[20]。

本文選用10 種主產(chǎn)地為廣東境內(nèi)的藥食兩用植物原料（益智仁、藿香、龍眼肉、橘紅、橘皮、高良姜、沙姜、肉豆蔻、佛手、布渣葉）乙醇提取物為研究對(duì)象，以清除DPPH 自由基和羥自由基活性為指標(biāo)研究其抗氧化活性，以抑制小鼠結(jié)腸癌MC-38 細(xì)胞增殖活性為指標(biāo)研究其抗腫瘤活性，為進(jìn)一步研究藥食兩用植物的開發(fā)和利用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

益智仁（湛江雷州）、藿香（肇慶高要）、龍眼肉（茂名高州）、橘紅（茂名化州）、陳皮（江門新會(huì)）、高良姜（湛江徐聞）、沙姜（陽江陽春）、肉豆蔻（佛山南海）、佛手（肇慶四會(huì)）、布渣葉（陽江陽西）廣州當(dāng)?shù)厮幉氖袌?chǎng)；小鼠結(jié)腸癌MC-38 細(xì)胞株 中國科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫；0.25%胰 酶-EDTA、高 糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）美國Life-Technologies 公司；CCK-8 試劑盒 日本同仁化學(xué)研究所；兒茶素、沒食子酸、Folin-ciocalteu 試劑 美國Sigma-Aldrich 公司；DPPH 自由基 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；0.22 μm的過濾器 美國Millipore 公司；96 微孔板、75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶美國Corning 公司；其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

3001 型酶標(biāo)儀、240i 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo 公司；熒光倒置顯微鏡 德國Leica 儀器公司；BSC-1300ⅡA2 系列生物安全柜 蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；5418 R 型冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 廣東藥食兩用植物活性物質(zhì)的提取 參照文獻(xiàn)[21]方法進(jìn)行并做改進(jìn)。具體方法為：用粉碎機(jī)將原料粉碎，80 目過篩，取樣品粉10 g，以w:v=1:20加入70%乙醇，85 ℃熱水浴回流提取1 h，4000 r/min離心15 min，分離得濾液。濾渣分別進(jìn)行第二和第三次提取和離心。將三次濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 mL 以內(nèi)（45 ℃），定容至25 mL，每種樣品的做三次平行提取實(shí)驗(yàn)，得濃度為400 mg/mL 的提取物樣品，分裝保存于-80 ℃，備用。

1.2.2 總黃酮和總多酚含量的測(cè)定 藥食兩用植物總黃酮含量的測(cè)定采用AlCl3-NaNO2比色法[22]進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)品為兒茶素，總黃酮含量以（平均值±SD）μmol 兒茶素當(dāng)量/g 干物質(zhì)（μmol CE/g DW）表示?？偠喾雍康臏y(cè)定采用Folin-Ciocalteu 法[23]進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)品為沒食子酸，總多酚含量以（平均值±SD）μmol 沒食子酸當(dāng)量/g 干物質(zhì)（μmol GAE/g DW)表示。

1.2.3 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 DPPH 自由基清除活性的測(cè)定 DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[24]來進(jìn)行。樣品組為藥食兩用植物提取物（濃度范圍為0～4 mg/mL）和0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，對(duì)照組為去離子水和0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，空白組為去離子水和乙醇，均為1:1 混合均勻，在溫室避光保存30 min，測(cè)定517 nm 處的吸光值。

其中，Ai—樣品組的吸光值；Aj—空白組的吸光值；A0—對(duì)照組的吸光值。

根據(jù)lg（Ei/1-Ei）與lg（濃度）的線性關(guān)系來計(jì)算樣品的半數(shù)有效清除濃度EC50（即DPPH 自由基清除率達(dá)到50%的提取物濃度），結(jié)果以EC50值（平均值±SD）mg/mL 表示。

1.2.3.2 羥自由基清除活性的測(cè)定 羥自由基清除實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[25]來進(jìn)行并做改進(jìn)。比色管中先依次加入9 mmol/L FeSO4為0.2 mL 和9 mmol/L 乙醇-水楊酸0.2 mL，接著加入濃度為40 mg/mL（即稀釋10 倍）的樣品2.4 mL（對(duì)照組為去離子水），最后加入8.8 mmol/L H2O20.2 mL（空白組不加入H2O2），搖勻，37 ℃恒溫水浴15 min 后取出，在510 nm 條件下測(cè)其吸光度。羥自由基清除率的計(jì)算參照1.2.3.1 DPPH 自由基清除率計(jì)算公式，結(jié)果以40 mg/mL 藥食兩用植物提取物對(duì)羥自由基的清除率（%）來表示。

1.2.4 抗增殖活性的測(cè)定 抗增殖活性按文獻(xiàn)[26-27]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并稍作改進(jìn)。在37 ℃ 5% CO2條件下，用DMEM（10% FBS）培養(yǎng)基培養(yǎng)MC-38 細(xì)胞。用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，離心，將MC-38 單細(xì)胞懸液200 μL 接種至透明96 微孔板中（1.5×104個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后（7 h），將生長(zhǎng)培養(yǎng)基吸出，清洗貼壁細(xì)胞（1×PBS），樣品組：加入200 μL/孔，均含10%提取物（即濃度分別為4、8、16、24、32、40 mg/mL）生長(zhǎng)培養(yǎng)基，對(duì)照組：加入200 μL/孔含10% PBS 生長(zhǎng)培養(yǎng)基，空白組：加入200 μL/孔生長(zhǎng)培養(yǎng)基（不接種細(xì)胞），每個(gè)梯度接種8 個(gè)平行孔。培養(yǎng)72 h 后將提取物吸出，清洗貼壁細(xì)胞（1×PBS），按照CCK-8 試劑盒進(jìn)行操作，加入150 μL/孔CCK-8工作液（CCK-8:DMEM 按1:9 配制），培養(yǎng)80 min，每孔吸出120 μL 至新96 孔板的對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，在450 nm處測(cè)定其吸光度。增殖抑制率的計(jì)算參照1.2.3.1 DPPH 自由基清除率計(jì)算公式，結(jié)果以藥食兩用植物提取物的半最大效應(yīng)濃度（即MC-38 細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到50%的提取物濃度）EC50（平均值±SD）mg/mL表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均為三次平行，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±SD 表示，作圖用Sigmaplot 10.0 軟件，數(shù)據(jù)處理用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，平均值的差異顯著性用one-way ANOVA 的Duncan 檢驗(yàn)，P＜0.05 視為有顯著性差異；相關(guān)性分析用雙變量相關(guān)進(jìn)行分析，P＜0.05 為顯著性相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣東藥食兩用植物的總黃酮含量

10 種廣東藥食兩用植物的總黃酮含量如圖1 所示，其中高良姜的總黃酮含量（85.76±3.25 μmol CE/g DW）最高，布渣葉（50.66±2.29 μmol CE/g DW）次之，隨后是橘紅（17.00±0.59 μmol CE/g DW）。其它藥食兩用植物的總黃酮含量高低依次是陳皮（8.61±0.29 μmol CE/g DW）、藿香（8.59±0.41 μmol CE/g DW）、肉豆蔻（6.76±0.37 μmol CE/g DW）、益智仁（4.49±0.22 μmol CE/ g DW）、佛手（4.15±0.12 μmol CE/ g DW），沙姜（0.80±0.05 μmol CE/g DW）和龍眼肉（0.69±0.03 μmol CE/g DW）的總黃酮含量最低，兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 10 廣東藥食兩用植物的總黃酮含量Fig.1 Total flavonoids contents of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

2.2 廣東藥食兩用植物的總多酚含量

由圖2 可見，10 種廣東藥食兩用植物中高良姜的總多酚含量（226.26±9.17 μmol GAE/g DW）最高，其次是橘紅（191.24±7.05 μmol GAE/g DW），再者是布渣葉（138.85±2.25 μmol GAE/g DW）。其它藥食兩用植物的總多酚含量高低依次是陳皮（62.03±2.83 μmol GAE/g DW）、佛 手（40.34±2.61 μmol GAE/g DW）、藿香（25.04±1.86 μmol GAE/g DW）、龍眼肉（24.57±1.15 μmol GAE/g DW）、肉豆蔻（19.15±0.76 μmol GAE/g DW）、益智仁（15.45±1.22 μmol GAE/g DW），沙 姜（7.52±0.67 μmol GAE/g DW）的總多酚含量最低。

圖2 10 種廣東藥食兩用植物的總多酚含量Fig.2 Total polyphenols content of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

2.3 廣東藥食兩用植物的抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基的清除活性 10 種廣東藥食兩用植物清除DPPH 自由基的EC50值見圖3，其中高良姜（EC50為0.058±0.001 mg/mL）清除DPPH 自由基活性最強(qiáng)，其次是布渣葉（0.164±0.008 mg/mL），再者是橘紅（0.525±0.024 mg/mL）。其它藥食兩用植物清除DPPH 自由基活性的強(qiáng)弱依次是佛手（0.759±0.045 mg/mL）、藿香（0.793±0.053 mg/mL）、肉豆蔻（0.964±0.032 mg/mL）、陳皮（1.001±0.086 mg/mL）、益智仁（1.467±0.115 mg/mL）、龍眼肉（1.534 ±0.131 mg/mL），沙姜（7.336±0.310 mg/mL）的清除DPPH 自由基活性最弱。

圖3 10 種廣東藥食兩用植物的清除DPPH 自由基EC50 值Fig.3 Scavenging DPPH free radical EC50 of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

2.3.2 羥自由基的清除活性 10 種廣東藥食兩用植物的羥自由基清除率如圖4 所示，其中沙姜（羥自由基清除率為92.42%±1.03%）、益智仁（90.85%±1.28%）、肉豆蔻（90.13%±0.74%）清除羥自由基的活性最強(qiáng)，三者之間無顯著性差異（P＞0.05）。其次是布渣葉（82.37%±1.18%），再者是龍眼肉（79.98%±0.83%）。其它藥食兩用植物清除羥自由基活性的強(qiáng)弱依次是橘紅（74.72%±1.04%）、高良姜（70.47%±2.13%）、藿香（63.17%±1.80%）、佛手（35.18%±1.18%），陳皮（21.49%±0.98%）的清除羥自由基活性最弱。

圖4 10 種廣東藥食兩用植物的羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rate of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

2.4 廣東藥食兩用植物的抗增殖活性

10 種廣東藥食兩用植物抗MC-38 細(xì)胞增殖活性的EC50值見圖5，其中陳皮（EC50值為1.29±0.08 mg/mL）和高良姜（EC50值1.93±0.10 mg/mL）抗增殖活性最強(qiáng)，兩者無顯著性差異（P＞0.05）。其次是布渣葉（2.62±0.14 mg/mL），再者是肉豆蔻（5.21±0.36 mg/mL），其它藥食兩用植物的抗增殖活性強(qiáng)弱依次是橘紅（8.00±0.33 mg/mL）、藿香（8.46±0.44 mg/mL）、沙姜（10.23±0.58 mg/mL）、益智仁（12.99±0.41 mg/mL）、佛手（18.43±0.74 mg/mL），龍眼肉（23.32±0.82mg/mL）的抗增殖活性最弱。

圖5 10 種廣東藥食兩用植物的抗增殖活性EC50 值Fig.5 Antiproliferative activities EC50 of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

2.5 廣東藥食兩用植物功效與含量的相關(guān)性

由表1 可以看出，10 種廣東藥食兩用植物的DPPH 自由基清除活性與其總黃酮含量之間的正相關(guān)性顯著（r=0.383，P＜0.05），其中總黃酮含量相對(duì)較低的佛手清除DPPH 自由基的活性較高。植物活性功效雖然受劑量效應(yīng)的影響，但植物成分種類、協(xié)同作用以及構(gòu)效關(guān)系對(duì)植物功效的影響仍然占重要地位[28-30]。因此，不能單從活性物質(zhì)含量來推測(cè)藥食兩用植物相關(guān)功效活性的強(qiáng)弱?？乖鲋郴钚耘c其總黃酮含量之間的正相關(guān)性極顯著（r=0.560，P＜0.01），但陳皮的總黃酮含量相對(duì)較低，其抗MC-38 細(xì)胞增殖活性卻最高。10 種廣東藥食兩用植物的DPPH 自由基清除活性與其總多酚含量之間的正相關(guān)性顯著（r=0.439，P＜0.05），其中陳皮的總多酚含量相對(duì)較高，但其清除DPPH 自由基的活性偏低；抗增殖活性與其總多酚含量之間的正相關(guān)性極顯著（r=0.498，P＜0.01），其中陳皮和肉豆蔻的總多酚含量相對(duì)較低，其抗MC-38 細(xì)胞增殖活性卻較高，總黃酮含量相對(duì)較高的橘紅和佛手，其抗MC-38 細(xì)胞增殖活性的活性卻偏低。10 種廣東藥食兩用植物的羥自由基清除活性與其總黃酮和總多酚含量之間的相關(guān)性均不顯著（r=0.059，P＞0.05；r=-0.308，P＞0.05）。

表1 10 種廣東藥食兩用植物活性物質(zhì)含量與功效的相關(guān)性Table 1 Correlation between content and efficacy of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

3 結(jié)論

在10 種廣東藥食兩用植物中，總黃酮含量最高為高良姜（85.76±3.25 μmol CE/g DW），含量最低為沙姜（0.80±0.05 μmol CE/g DW）和龍眼肉（0.69±0.03 μmol CE/g DW），兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）；總多酚含量最高為高良姜（226.26±9.17 μmol GAE/g DW），含量最低為沙姜（7.52±0.67 μmol GAE/g DW）；清除DPPH 自由基活性最強(qiáng)的高良姜（EC50為0.058±0.001 mg/mL），活性最弱為沙姜（EC50為7.336±0.310 mg/mL）。清除羥自由基活性最強(qiáng)為沙姜、益智仁和肉豆蔻（清除率分別為92.42%±1.03%、90.85%±1.28%、90.13%±0.74%），三者之間無顯著性差異（P＞0.05），活性最弱為陳皮（清除率為21.49%±0.98%）。抗MC-38 細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)為陳皮（EC50值為1.29±0.08 mg/mL）和高良姜（EC50值為1.93±0.10 mg/mL），兩者無顯著性差異（P＞0.05），活性最弱為龍眼肉（EC50值為23.32±0.82 mg/mL）。

10 種廣東藥食兩用植物的DPPH 自由基清除活性與其總黃酮和總多酚含量之間正相關(guān)性均顯著（相關(guān)系數(shù)分別為r=0.383，P＜0.05；r=0.439，P＜0.05）；抗MC-38 細(xì)胞增殖活性與其總黃酮和總多酚含量之間正相關(guān)性均極顯著（r=0.560，P＜0.01；r=0.498，P＜0.01）；羥自由基清除活性與其總黃酮和總多酚含量之間相關(guān)性均不顯著（r=0.059，P＞0.05；r=-0.308，P＞0.05）。藥食兩用植物的活性功效雖有劑量效應(yīng)，但還受到其成分種類、協(xié)同作用以及構(gòu)效關(guān)系等的影響。