基于SNP標記的肉產(chǎn)品溯源研究進展

王彥云 楊曙明

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京100081）

肉產(chǎn)品味道鮮美，是最富營養(yǎng)價值的動物性食品之一。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和消費結(jié)構(gòu)的改變，肉產(chǎn)品在餐桌上占的比重不斷增加。但是由于政府監(jiān)管不足、企業(yè)責任意識欠缺、消費者安全意識薄弱，一些肉產(chǎn)品安全事件給國內(nèi)行業(yè)發(fā)展、消費者信心、政府公信力、國際形象等方面造成較大沖擊。針對肉產(chǎn)品的加工、生產(chǎn)、銷售全過程建立追溯管理體系，是控制肉產(chǎn)品質(zhì)量安全最常用的方法[1]。追溯體系的建立，有助于從源頭有效控制污染的傳播范圍，將對社會的影響降到最低[1]。對動物個體及產(chǎn)品的追溯管理，是保證食品質(zhì)量安全、保護消費者合法權益的重要手段[2]。

SNP（single ncleotide polymorphism）， 又名單核苷酸多態(tài)性，是基因組水平上單個堿基的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性，屬于第三代遺傳標記技術。本文對現(xiàn)有SNP標記在肉產(chǎn)品溯源以及肉類品種溯源方面的研究進行了歸納，有利于今后SNP標記技術在肉產(chǎn)品溯源領域更為廣泛的應用。

一、SNP標記及其特點

分子標記（molecular markers）在溯源中是一個非常重要的概念，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映，早在20世紀末就已經(jīng)被廣泛應用于動植物的育種研究、性狀與基因的研究。分子標記自誕生之日起不斷發(fā)展，逐漸應用于肉產(chǎn)品的溯源研究與應用中。動物個體的生長發(fā)育，往往會使得其外部形態(tài)發(fā)生極大的變化；同時，肉產(chǎn)品在加工處理后，也會加大溯源難度。然而，基于分子標記技術的溯源方法不受產(chǎn)品形態(tài)的影響，可以逆行對品種個體做到準確鑒定[3～4]。20世紀90年代，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）首次見于人類分子遺傳雜志，成為繼擴增片段長度多態(tài)性（amplified restriction fragment polymorphism，AFLP）和簡單重復序列多態(tài)性（simple sequence repeat，SSR）之后的第3代遺傳標記技術。由于具有存在廣泛、遺傳穩(wěn)定性高、富有代表性以及易實現(xiàn)分析的自動化等特點，SNP溯源技術廣泛應用于溯源研究[5～7]，已實現(xiàn)在豬肉、羊肉和牛肉等畜禽個體及產(chǎn)品溯源中的成功應用。

（一）數(shù)量多且分布廣SNP在基因組中存在廣泛，可位于基因編碼區(qū)、基因的非編碼區(qū)以及基因間區(qū)（基因和基因之間）。就人類基因組而言，SNP的總量超過300萬個。在哺乳動物中，平均每500～1 000個堿基，就有一個多態(tài)性位點，利用基因上以及基因與基因之間廣泛存在的SNP位點，可以建立一系列的標記，通過變異位點、變異序列與性狀關系的研究，可以對個體和群體間基因上的差異有更深的了解[8～9]。

（二）遺傳穩(wěn)定性高SNP的形成是歷史進化的結(jié)果，通常來說，先形成的SNP比之后形成的SNP在種群中所占的比率要高。相比于其他分子標記，SNP標記為單核苷酸的突變，且突變頻率很低，與一些不良性狀也不存在連鎖遺傳，因此屬于可遺傳的變異，遺傳穩(wěn)定性高[10～12]。

（三）富有代表性已有研究表明，位于基因內(nèi)部的某些SNP可能直接影響動物機體蛋白質(zhì)的合成與表達，通常直接表現(xiàn)為個體差異和種群差異。SNP所含有的這種特性使其在復雜性狀研究以及在動物個體鑒定、種間鑒定和產(chǎn)地溯源方面有天然的優(yōu)勢[2]。

（四）易實現(xiàn)分析的自動化自然界中的大部分生物是二倍體。在二倍體生物中，SNP等位基因只有一對，也叫作雙等位基因?；赟NP的這種遺傳二態(tài)性，一個SNP理論上可以區(qū)分3種基因型，從而可以對3個動物個體作出鑒定。傳統(tǒng)的遺傳標記方法，例如限制性片段長度多態(tài)性、微衛(wèi)星，需要對片段的長度作出測量，過程繁瑣、工作量大，而SNP檢測結(jié)果的分析只需要判斷結(jié)果只是顯示為需要＋/－即可。SNP的二態(tài)性也有利于進行基因分型和自動化篩選，這使得基于SNP的檢測分析方法易實現(xiàn)自動化[13～17]。

二、SNP的開發(fā)

要實現(xiàn)DNA分子標記技術在肉產(chǎn)品溯源實踐中的應用，需要開發(fā)滿足要求的SNP。一般來說，SNP的開發(fā)方法有兩種，一是根據(jù)美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）等數(shù)據(jù)庫及文獻中已報道的SNP位點，通過群體驗證選擇標記位點；二是基于性狀基因新位點的開發(fā)，選擇當前文獻中已報道的與肉質(zhì)及體態(tài)性狀相關基因擴增，并對多樣本測序結(jié)果進行比對，得到新的SNP位點。

（一）基于數(shù)據(jù)庫和文獻的位點開發(fā)基于數(shù)據(jù)庫和文獻的位點開發(fā)是SNP開發(fā)的最主要的途徑，主要包括3方面內(nèi)容：（1）位點的挑選。通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)合參考文獻，依據(jù)一定標準進行位點的挑選。（2）位點同源性分析。由于一部分位點存在多高同源，即位點所在的基因區(qū)段與基因組內(nèi)其他區(qū)段同源性很高。這些位點做PCR檢測的時候也都會被擴增出來，影響結(jié)果的判讀，不適合做高通量測序，因此需要對挑選的位點進行同源性分析，舍去高同源性位點。（3）位點的驗證。篩選后的位點，經(jīng)多重PCR擴增模板，產(chǎn)物純化后上高通量基因分型平臺進行測定，將沒有測出的位點剔除，剩下各位點在測試群體中的等位基因頻率、基因型頻率通過直接計數(shù)方式獲得[18]。

（二）基于性狀基因的位點開發(fā)基于性狀基因的位點開發(fā)，是通過對多樣本目的基因的測序結(jié)果進行比對，從而發(fā)掘新的多態(tài)性位點，主要內(nèi)容包括：（1）目的基因的挑選。通過NCBI等數(shù)據(jù)庫檢索及文獻報道，選擇與研究對象生長性狀、肉質(zhì)性狀相關的基因。（2）目的基因的擴增。利用Primer Premier5.0等軟件設計通用引物，引物合成后，混合DNA模板確定引物最佳退火溫度，同時考察引物擴增效率及特異性，舍去擴增效率低及有雜片段的引物，采用余下引物對包含研究對象樣本分別進行PCR擴增。（3）多序列比對。對多樣本目的基因擴增產(chǎn)物做Sanger測序，通過SeqMan軟件比對多樣本相同擴增序列，獲得目標樣本候選多態(tài)性位點。

分子標記的開發(fā)是DNA溯源應用的關鍵，研究表明，分子標記、基因和性狀之間存在重要的聯(lián)系。通過SNP分析方法定位數(shù)量性狀位點（Quantitative Trait Loci，QTL）的研究，以及分子標記連鎖群的構(gòu)建及其應用，人們對分子標記、基因和性狀三者之間的關系有了更加全面的認識。在研究基礎上，通過選擇感興趣的目的基因，可以開發(fā)更多新的SNP，使得SNP在動植物育種和溯源方面的應用更加廣泛。

三、SNP分型檢測方法

SNP是單核苷酸突變引起的變異，可以檢測單核苷酸突變的的方法均可以用于SNP的鑒定。理想的SNP分型方法應滿足5個方面，即對突變位點的檢測快速準確；檢測成本低，開發(fā)時間短；反應體系穩(wěn)定，樣品質(zhì)量要求低；數(shù)據(jù)分析簡單準確；高通量，自動化[19～20]。SNP分型方法眾多，幾種主要的SNP檢測方法及其適用范圍見表1。

SNP作為新一代分子標記技術，因其數(shù)量豐富，遺傳穩(wěn)定性高，易于自動化分型等諸多優(yōu)點，引發(fā)了廣大研究者的濃厚興趣，新的高通量的檢測方法也不斷被開發(fā)出來。然而，目前的檢測方法還不能完全滿足以上要求。未來SNP的檢測分型方法應根據(jù)適用范圍，在更擅長的領域做更精細的提升，如在高通量應用領域，應該更著眼于獲得數(shù)據(jù)的有效性；在中等通量的應用領域，更多考慮到中小型實驗及臨床應用需求；在現(xiàn)場快速檢測領域，應朝著簡便、快速、便攜式方向發(fā)展[9]。

表1 SNP檢測方法與適用范圍

四、SNP標記在肉產(chǎn)品溯源中的應用

基于SNP標記的肉產(chǎn)品溯源研究由來已久，而且在某些領域的應用已取得成功。用于肉類溯源的SNP標記應用在個體和種群中具有較高的多態(tài)性、分布廣，且能穩(wěn)定遺傳，檢測簡單等特點[35～38]。以往SNP標記用于肉產(chǎn)品溯源主要有3個目的：（1）肉類品種的鑒別，即特殊肉產(chǎn)品與普通肉產(chǎn)品的鑒定。（2）個體來源的鑒定。（3）產(chǎn)品產(chǎn)地的鑒別，主要是以種間差異和遺傳背景為基礎的品種鑒別，如進口肉與本國肉的鑒定。

（一）肉類品種的鑒別DNA技術的發(fā)展使得分子方法在傳統(tǒng)牛肉溯源中的應用成為可能。近年來，微衛(wèi)星已成為最常用的標記方法，然而SNPs正在取代它們。近年來，SNP在品種溯源方面的研究眾多，并在一些領域取得了很大成功，比如牛、羊、 豬的品種溯源研究[38～39]。

ZHAO等[40]用10個SNP標記鑒定我國市場上的牦牛肉和普通牛肉。隨機選取不同品種的牦牛樣品和普通牛樣品各16份，在普通牛群體中有多態(tài)性但在牦牛中為單態(tài)性的15個突變位點被確定為SNP候選位點。全部15個SNP候選位點，在16份牦牛樣品中均為純合子，在16份普通牛樣品中既有純合又有雜合。從中選取了10個SNP位點，并設置了一個陽性對照引物對牦牛進行鑒定。牦牛樣品一般產(chǎn)生1～3個波峰，普通牛樣品在電泳圖譜上有5個或5個以上波峰。該方法被成功地應用于一種聲稱由牦牛制成的產(chǎn)品實際上是一種普通牛肉產(chǎn)品的鑒別。

SASAZAKI等[41]使用SNP標記技術對日本本國牛和進口外國牛進行了溯源研究。日本牛樣品446頭，包括日本黑牛和日本荷斯坦牛，進口牛樣品388頭，包括美國牛和澳大利亞牛。按照446頭日本牛中，等位特異性基因只存在于進口牛中的標準，嚴格挑選11個SNP標記，對美國和澳大利亞牛的鑒定概率超過9.60×10－2。進口牛的高特異性使得日本牛和進口牛鑒定的準確度和可信程度得到保障。

NISHIMURA等[42]對日本黑牛、F1（日本黑牛×荷斯坦牛）和荷斯坦牛進行了SNP的溯源研究。使用樣本（荷斯坦牛2 590頭，日本黑牛1 341頭），用牛SNP50K微珠芯片檢測了54 001個SNP，篩選了符合標準的SNP35 844個，分別用PCA分析和線性判別分析的方法對其作了分析。結(jié)果表明，線性判別法對標記物的判別效果優(yōu)于主成分分析（principal component analysis，PCA），用這個線性分析式，能將荷斯坦牛與日本黑牛完全鑒定區(qū)分出來，然而做不到荷斯坦牛和F1牛的鑒定，在此臨界值下，日本黑牛被誤判為荷斯坦牛和F1的錯誤概率<5.79×10－4。與此同時，荷斯坦牛和F1被誤判為日本黑牛的錯誤概率分別<8.00×10－3（F1） 和2.66×10－5（荷斯坦牛）。

KAWAGUCHI等[43]用6個SNP標記鑒別日本本國和牛和澳大利亞和牛。于新加坡13個市場購得143份澳大利亞和牛樣品，對47個SNP標記進行分型處理并使用DigiTag2分析，排除識別為來自同一個體的樣品，最終確定了不同個體樣品130個。6個SNP標記從已有研究中選擇[41，44～45]， 根據(jù)每個標記的等位基因頻率估計，計算被鑒定為澳大利亞和牛的概率，對6個SNP標記的鑒定效果進行評價。由6個SNP標記組成的系統(tǒng)，從日本本國和牛和澳大利亞和牛中鑒定出澳大利亞和牛的概率為77.6%，這個值低于SASAZAKI等[41，44]通過相同6個標記對正常澳大利亞牛的概率計算值9.25×10－1，但可以滿足日本本地和牛與澳大利亞和牛鑒定的要求。

（二）個體來源的鑒定傳統(tǒng)的動物個體溯源方法采用的是給動物佩戴耳標的方式進行個體信息的記錄[46～47]，DNA分子標記溯源技術恰好可以彌補動物耳標及條碼技術的不足，一是該技術可以溯源到個體、品種甚至生物種類；二是DNA無法更改，且穩(wěn)定，加工肉制品仍可獲得較高質(zhì)量的DNA[48～49]。因此，將傳統(tǒng)的記錄系統(tǒng)與DNA標記技術有機結(jié)合，可以真正實現(xiàn)養(yǎng)殖－屠宰－加工－運輸－銷售的全鏈條的溯源[50～51]。

吳瀟等[52]用18個SNP對我國市場上的豬個體進行鑒定。挑選了我國市場上主要的豬品種共10種、233只（均采自上海崇明富農(nóng)豬場），對這些豬肉樣品進行檢測，共發(fā)現(xiàn)33個SNP，通過雜合度計算進一步篩選得到6個豬肉DNA溯源SNP，分型方法選用內(nèi)切酶的方法。這6個豬肉的DNA溯源SNP與張小波等[53]研究發(fā)現(xiàn)的12個豬肉DNA溯源SNP一起使用，理論上能鑒定3.87×108只豬個體，可以用于大規(guī)模的豬只個體識別和追溯。

ZHAO等[54]使用18個SNP組合，實現(xiàn)對我國市場清真牛個體鑒定和牛肉追溯。實驗樣品共176個，涵蓋我國市場上主要的7個清真牛品種（絕大部分樣品牛個體為雄性）。檢測并篩選出符合標準的SNP標記59個，運用多重熒光PCR技術，對7個不同品種176個牛個體DNA組中59個SNP進行分型分析。4個SNP未檢出棄去，棄去最小等位基因在各自種群中＜20%以及在混合物種中＜30%的SNP位點，最后剩余36個符合標準的SNP。選擇多態(tài)性最高的18個SNP一起使用，可以實現(xiàn)任意兩個清真牛個體被確定為同一個體的概率為7.97×10－10，在相同SNP情況下，鑒定效果好于ORRùL等[18]的歐洲牛個體鑒定的SNP組合。

（三）產(chǎn)品產(chǎn)地的鑒別產(chǎn)品產(chǎn)地的鑒別，主要依據(jù)地理分布差異以及不同遺傳背景造成的動物種群差異，利用遺傳標記對存在種間差異的動物個體及種群所屬產(chǎn)地作一鑒定。

ROGBERG-MUNOZ等[55]基于Illumina MiSeq高通量測序平臺對我國黃牛牛肉與進口牛肉混合樣本進行基因組測序，利用開發(fā)的95個SNP標記對我國黃牛和9個國外品種牛進行聚類分析，本研究使用的方法可以正確區(qū)分英國品種和我國本地品種，這為利用SNPs檢測我國市場上的外國品種肉類提供了可能性。

黃樹文等[56]基于SNP芯片對廣東省5個地方豬種作了遺傳多樣性分析，利用Illumina 60K芯片對大花白豬、梅花豬、藍塘豬、粵東黑豬進行SNP分型，利用Geenseek 80K芯片對廣東小耳花豬進行SNP分型。其中，梅花豬原為大花白豬的1個類群，但其體型外貌與大花白豬差異較大，為便于分析，將大花白豬和梅花豬作為2個不同品種進行分析。對照組為杜洛克豬、長白豬、大白豬、皮特蘭豬4個西方商業(yè)豬種以及歐洲野豬和亞洲野豬，這些豬種的SNP數(shù)據(jù)均下載自網(wǎng)絡共享平臺（http://datadryad.org/）。整合芯片結(jié)果，共獲得31 161個SNP位點。使用主成分分析對群體結(jié)構(gòu)進行分析，可以將廣東省地方豬種與西方豬種分為2類，其中，亞洲野豬與廣東省地方豬種聚為一類，歐洲野豬與西方豬種聚為一類。

五、結(jié)語

SNP技術在肉產(chǎn)品溯源方面的研究具有很大的優(yōu)勢，然而在實際應用方面，要大范圍推廣存在諸多困難，比如動物個體和品種的鑒別，由于樣本種群的地理和遺傳背景差異，初次篩選的SNP位點在不同個體和群體間的適用性往往不高，通常需要不斷優(yōu)化樣本篩選的方法、擴大樣品數(shù)量來獲得理想的SNP組合。然而隨著研究的不斷深入、相關領域數(shù)據(jù)庫的逐步建立，SNP的研究應用將逐步走向成熟，以SNP標記為特征的肉產(chǎn)品溯源技術，將在今后的溯源應用和食品安全保障方面，發(fā)揮更為重要的作用。