西羅莫司涂層氣管支架在氣管狹窄動物模型中的應(yīng)用

李宗明, 張全會, 韓新巍, 焦德超, 任克偉, 路慧彬

自1891年Bond用一根T形塑料管治療氣管狹窄獲得了成功以來，氣道支架在氣道狹窄治療方面取得了長足進步，尤其是在惡性氣道狹窄治療方面已被臨床公認(rèn)為是一種快速有效的急救手段。目前臨床上常用支架主要有鎳鈦記憶合金支架和硅酮支架，在良性氣道狹窄治療方面暴露出了局限性，支架磨損氣道粘膜導(dǎo)致炎性修復(fù)，肉芽組織過度增生導(dǎo)致氣道再狹窄，嚴(yán)重影響支架治療效果。

有學(xué)者[1,2]嘗試氣管鏡下于肉芽組織增生處局部多點單次注射抗增殖藥物，也有學(xué)者[3,4]嘗試在支架表面涂抹抗增殖藥物，但由于藥量小，釋放快，作用時間短，沒能有效抑制肉芽組織的增生。本課題首先制作氣管狹窄動物模型，嘗試在氣管支架表面涂抹緩慢降解的藥物涂層，逐漸釋放抗增殖藥物，起到長時間抑制肉芽組織增生的效果。

材料與方法

1.對象

選用2.5～3.0 kg新西蘭大耳白兔36只，雌雄不限，分成對照組(n=18只)，置入普通鎳鈦合金裸支架，實驗組(n=18只)，置入西羅莫司涂層鎳鈦合金裸支架；每組內(nèi)根據(jù)處死時間分為1個月組、2個月組和3個月組，各6只。

2.方法

氣管狹窄動物模型建立:0.5 mL速眠新肌肉注射麻醉，將實驗兔固定在實驗臺上，備皮、消毒、鋪巾，逐層切開皮膚、皮下肌肉，暴露出頸部氣管，氣管軟骨環(huán)間切開氣管約1 cm，通過切口送入毛刷(圖1a)于切口下1 cm環(huán)形破壞氣管粘膜(圖1b)，縫合氣管切口，并逐層縫合皮下組織和皮膚，消毒包扎。術(shù)后3d內(nèi)耳緣靜脈注射美洛西林注射液。1個月后復(fù)查胸部CT(圖1c)，建立兔氣管狹窄動物模型。

圖1 a) 用于破壞氣管粘膜的毛刷； b) 氣管環(huán)間切開氣管，毛刷破壞氣管粘膜； c) 胸部CT掃描氣道重建顯示氣管中部狹窄(箭)。 圖2 a) 導(dǎo)管進入右下葉支氣管內(nèi)； b) 沿導(dǎo)絲送入支架及其輸送系統(tǒng)； c) 準(zhǔn)確定位支架于氣管狹窄處，釋放支架。 圖3 支架涂層后掃描電鏡掃描。a) 支架金屬絲表面浸涂均勻藥膜； b) 支架折疊再展開后支架金屬絲表面藥物部分脫落； c) 支架金屬絲交匯處藥膜不均勻(箭)。

藥物涂層支架制備:實驗儀器及器械：電熱鼓風(fēng)干燥箱、電子天平、超聲波清洗器、恒溫孵箱、紅外光譜儀、掃描電子顯微鏡。

試劑：聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic acid-glycolic acid copolymer，PLGA)(75:25，Mr=10000)、西羅莫司原料藥、甲醇、二氯甲烷。

支架：鎳鈦合金裸支架，管狀， 8 mm×20 mm型號。支架清洗：將鎳鈦合金支架置入于有機溶劑二氯甲烷中浸泡2h后取出，置于通風(fēng)櫥內(nèi)2h，待二氯甲烷完全揮發(fā)后將支架置于超聲波清洗器中清洗20 min去除支架表面雜質(zhì)，烤箱中50°C烤干備用。

制備藥物涂層支架：配制西羅莫司與PLGA質(zhì)量比1:10的浸涂液，以二氯甲烷為溶劑配制2.5%PLGA溶液13 mL，精確稱量西羅莫司，以甲醇為溶劑配制西羅莫司的甲醇溶液7 mL，之后將兩種溶液混合。將清洗過的鎳鈦合金支架置于溶液中浸涂20 min，然后將支架置于40℃烤箱中烘烤4h使溶劑充分揮發(fā)，按上述操作再次浸涂20 min后取出烘干，將支架壓入支架輸送器后環(huán)氧乙烷消毒備用。

紅外光譜儀檢測：配制PLGA-西羅莫司浸涂液，使溶劑揮發(fā)后制成PLGA-西羅莫司藥膜樣本。利用紅外光譜儀分別檢測西羅莫司，PLGA及PLGA-西羅莫司藥膜樣本，通過檢測PLGA與西羅莫司是否在支架制備過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

掃描電鏡觀察：取制備好的氣管藥物涂層支架及從輸送器中推送出的藥物涂層支架各一個，常規(guī)噴金后行掃描電鏡檢測，觀察支架表面涂層情況。

3.涂層支架藥物的體外緩釋實驗

實驗儀器：Agilent1200 高效液相色譜儀、1200 DAD 檢測器、電子天平(梅特勒，Newclassic)、KH-250B 超聲波清洗器、ST16R 低溫離心機。

試劑：二水合磷酸二氫鈉(北京化工廠，批號20100512，分析純)、十二水合磷酸氫二鈉(北京化工廠，批號20170106，分析純)、甲醇(北京百靈威科技有限公司，批號L170T96，色譜純)、乙腈(上?；魡鵂栙Q(mào)易有限公司，批號Q70A1H，色譜純)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(北京百靈威科技有限公司，批號LM70T82，純度：98.5%)。

萃取液：① 0.01M PBS 溶液：準(zhǔn)確稱取 NaH2PO4·12H2O 0.441 g、Na 2 HPO4·2 H2O 1.368 g，加入1 L水溶解；②0.02% BHT乙腈溶液：精密稱取BHT 100 mg至500 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容，混勻；③取0.01M PBS溶液650 mL和0.02% BHT乙腈溶液350 mL搖勻，即得萃取液。

支架處理：將藥物涂層支架至10 mL棕色瓶中，加適量支架萃取液覆蓋支架，超聲(240W)20 min取樣，用萃取液定容至刻度，混勻，取適量提取溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，23755 g離心10 min，取上清液200 μL至進樣襯管中。

質(zhì)控溶液：取精密稱取9.93 mg至100 mL棕色量瓶中，加入萃取液溶解后稀釋至刻度，混勻。精密量取上述溶液1 mL至10 mL量瓶，萃取液稀釋至刻度(10，萃取液稀釋)；精密量取上述溶液5～10 mL量瓶中，萃取液稀釋至刻度(5瓶中/mL)，精密量取5，精密量取液溶液3～10 mL量瓶中，萃取液稀釋至刻度(1.5，萃/mL)。將10將，萃取液稀、50將，萃取液、1.5，萃取液稀釋對照品溶液濾過，取濾液至棕色液相小瓶。樣品測定：將上述藥物支架預(yù)處理液及質(zhì)控溶液進樣色譜純法分析。

圖4 雷帕霉素涂層支架釋放液測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5 a) 單純鎳鈦合金支架組氣管粘膜內(nèi)大量纖維素增生，膠原蛋白沉積，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(HE，×40)； b) 藥物涂層支架置入后1個月，實驗兔支架上緣氣道粘膜標(biāo)本光鏡檢查顯示少量纖維素增生，伴有炎性細(xì)胞浸潤(HE，×40)。

4.支架置入

肌肉注射速眠新0.5 mL麻醉氣管狹窄的動物模型。將實驗兔固定于DSA檢查床上，頭偏向右側(cè)，置入開口器，通過口腔送入5F單彎造影導(dǎo)管和0.035 inch親水膜導(dǎo)絲，兩者配合經(jīng)口腔，咽喉部進入氣管，并越過氣管狹窄處進入一側(cè)主支氣管(圖2a)，退出導(dǎo)管，沿導(dǎo)絲送入氣管支架及其輸送系統(tǒng)(圖2b)，準(zhǔn)確定位支架于狹窄處，釋放支架(圖2c)，退出支架輸送系統(tǒng)，給予肌肉注射麻醉蘇醒劑鹿醒寧0.5 mL。

5.實驗兔的處死及標(biāo)本留取

對照組和實驗組分別于支架置入后1個月、2個月和3個月復(fù)查胸部CT后處死相應(yīng)組別的實驗兔，觀察肉芽組織增生情況，并于支架上緣和下緣處取氣管粘膜行HE染色病理檢查。

6.統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。組間單因素比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)定位α=0.05，以P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.氣管狹窄動脈制備

在制作氣管狹窄模型過程中1只(1/36)死于麻醉過深，2只(2/36)在模型制作后3d左右因嚴(yán)重氣管粘膜充血水腫死亡，其余33只(33/36)氣管狹窄模型制作成功，補做33只均成功，狹窄程度50%～85%。

2.藥物涂層支架制備

掃描電鏡掃描發(fā)現(xiàn)支架折疊及展開后PLGA-西羅莫司藥膜有部分脫落，支架金屬交匯處藥膜涂層不均勻(圖3)。藥膜制備過程中藥物和載體沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

支架涂層前后稱重：藥物涂層前對支架進行超聲波清洗稱重，西羅莫司涂層后再次進行稱重，發(fā)現(xiàn)支架平均增重約0.37 mg(表1)。

表1 鎳鈦合金支架(8mm×20mm)載藥情況

3.涂層支架藥物體外緩釋情況

利用建立的方法測定了9個支架在240W超聲20 min條件下釋放情況，結(jié)果顯示雷帕霉素涂層支架體外釋放良好，能夠?qū)崿F(xiàn)緩慢釋放，防止排異反應(yīng)的目的(表2、圖4)。

表2 在體外釋放條件下釋放液中雷帕霉素含量

4.氣管支架置入

所有氣管狹窄模型均一次性成功置入氣管支架，支架置入術(shù)中及術(shù)后未出現(xiàn)窒息、出血、氣管穿孔等并發(fā)癥。

5.支架置入后氣管再狹窄

兩組氣管支架處均有不同程度的肉芽組織增生，以支架上緣為著。在3個實驗節(jié)點時，實驗組氣管狹窄程度均輕于對照組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 鎳鈦合金支架和藥物涂層支架置入后氣道再狹窄的程度

6.支架置入后氣管粘膜改變兩組實驗兔處死后分別于支架上下緣處取氣管粘膜，HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)單純鎳鈦合金支架組氣管粘膜內(nèi)大量纖維素增生，膠原蛋白沉積，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(圖5a)。而西羅莫司涂層支架組纖維素增生，膠原蛋白沉積明顯減少(圖5b)。

討 論

1891年Bong[5]首次采用氣管切開后置入T管方法治療聲門下氣管狹窄。Montgomery[6]1965年發(fā)明了T型管氣管支架。Dumon[7]1987年發(fā)明Dumon硅酮支架，硅酮支架大大提高了支架生物相容性，但是置入困難，需要全麻下借助硬質(zhì)支氣管鏡才能完成，硅酮支架管壁較厚，占據(jù)了較大的氣管內(nèi)空間，而且支架移位和痰液儲留發(fā)生率較高。1989年Simonds[8]發(fā)明了鎳鈦合金自膨式氣管支架，具有形狀記憶特性，且支架移位和痰液儲留發(fā)生率較低，一直沿用至今，并且衍生出許多不同形狀氣道支架用于滿足臨床需求。但是由于支架置入后氣道粘膜肉芽組織增生導(dǎo)致氣道再狹窄等問題長期困擾著臨床醫(yī)生[9]。

國內(nèi)外學(xué)者嘗試在支架表面添加抗增殖藥物。Choong等[10]在氣道支架表面涂覆絲裂霉素(mitomycin，MMC)，并且進行了相關(guān)動物實驗發(fā)現(xiàn)MMC涂層可以減輕氣道支架置入后肉芽組織增生且作用大小和MMC的劑量呈正相關(guān)。Choong等[11]又首次報道了紫杉醇涂層氣道支架動物實驗結(jié)果顯示支架置入后1周、1個月、2個月和3個月時，實驗組(置入紫杉醇涂層氣道支架)氣道通暢率為100%、96%、76%和65%，而對照組(置入未載藥氣道支架)氣道通暢率分別為10%、0%、0%和0%。Shin等[12]發(fā)明激素涂層支架(地塞米松-聚胺酯氣道支架)，研究發(fā)現(xiàn)地塞米松涂層支架可有效抑制肉芽組織增生。

本研究首先采用西羅莫司涂層，西羅莫司是一種大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，屬于細(xì)胞增殖抑制劑，可有效抑制細(xì)胞增殖且沒有明顯細(xì)胞毒性。選用PLGA為載體，通過PLGA的緩慢釋放達到藥物緩釋的效果。通過紅外光譜儀檢測發(fā)現(xiàn)PLGA和西羅莫司在制備浸涂液時沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，掃描電鏡檢測發(fā)現(xiàn)浸涂液可均勻的涂覆在支架金屬絲表面。實驗兔氣道狹窄動物模型真實的還原了氣管狹窄的病理生理環(huán)境。將未載藥的鎳鈦合金裸支架和PLGA載西羅莫司涂層氣道支架分別置入氣管狹窄模型兔氣管內(nèi)發(fā)現(xiàn)藥物涂層支架組氣道再狹窄的程度明顯輕于單純支架組。

本研究結(jié)果證明PLGA載載西羅莫司涂層氣道支架可有效抑制氣道支架置入后氣道粘膜肉芽組織增生，降低氣道再狹窄程度。但仍存在一些不足，包括載藥量較低、無法多次給藥以及藥物釋放速度和規(guī)律不明確等問題，需進一步研究。