耗竭巨噬細(xì)胞抑制脂多糖誘導(dǎo)小鼠腎臟及全身炎癥損傷的作用研究

安曉寧，魏兆楠，沈 艷，史 浩，張 文，陳永熙

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院a.腎臟科；b.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200025）

急性全身性炎癥如敗血癥會誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，嚴(yán)重影響多種器官組織的功能。在此過程中，單核巨噬細(xì)胞可經(jīng)多種途徑參與炎癥反應(yīng)，而炎癥部位的趨化因子與單核巨噬細(xì)胞表面的相應(yīng)受體作用，可誘導(dǎo)后者活化并向感染部位募集，活化的單核巨噬細(xì)胞又可進(jìn)一步誘導(dǎo)更多的巨噬細(xì)胞活化、募集?；罨木奘杉?xì)胞除可分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α） 等促炎因子外，還可調(diào)動其他粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，共同促進(jìn)包括腎臟在內(nèi)的局部和全身炎癥反應(yīng)。機(jī)體除了表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)外，各臟器也會出現(xiàn)相應(yīng)的病變。組織病理檢查可發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞在腎臟間質(zhì)中浸潤。臨床上，患者處于敗血癥等全身炎癥狀態(tài)下，可出現(xiàn)蛋白尿、血尿或血液及尿液中肌酐水平升高。

單核巨噬細(xì)胞參與了多種疾病的進(jìn)展，病理檢查常可發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在發(fā)生炎癥的組織中增殖和浸潤[1]。脊髓損傷、帕金森病及佐劑性關(guān)節(jié)炎等多種動物模型研究顯示，耗竭巨噬細(xì)胞可改善疾病損傷，但耗竭巨噬細(xì)胞對炎癥反應(yīng)所致腎臟損傷的保護(hù)作用，目前少有報(bào)道[2-3]。本研究采用選擇性集落刺激因子1 受體抑制劑GW2580 耗竭小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，觀察其對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠腎臟及全身炎癥反應(yīng)的作用，探究GW2580 對機(jī)體炎癥反應(yīng)及炎癥狀態(tài)下受累腎臟的影響，為進(jìn)一步探索GW2580 在炎癥損傷中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

1.動物：本研究所用C57BL/6JNifdc 小鼠購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)所用小鼠為8～10 周齡，共18 只雄鼠，體重為（25±5）g/只。

2.試劑和儀器：本研究所用儀器包括光吸收酶標(biāo)儀（BioTek）、流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）、正置熒光顯微鏡[卡爾蔡司（上海）管理有限公司]。實(shí)驗(yàn)試劑包括GW2580（大連美侖生物技術(shù)有限公司）、小鼠TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（BD Pharmingen,美國）、脂多糖（Sigma 公司，美國）、小鼠F4/80 BB700（BD Pharmingen，美國）、流式細(xì)胞術(shù)檢測染色緩沖液（BD Pharmingen，美國）、紅細(xì)胞裂解液（BD Pharmingen，美國）、尿液試紙條（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

二、方法

1.小鼠炎癥損傷模型的建立：根據(jù)文獻(xiàn)[4]的方法，采用腹腔注射LPS（3 mg/kg）的方式進(jìn)行炎癥誘導(dǎo)，建立小鼠炎癥損傷模型。首先進(jìn)行GW2580 耗竭巨噬細(xì)胞的預(yù)處理實(shí)驗(yàn)。GW2580 劑量根據(jù)文獻(xiàn)及本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用160 mg/kg[5]。預(yù)處理組小鼠（n=9）分別在GW2580 灌胃后第0、4、7 天時(shí)處死（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3 只），制備脾臟細(xì)胞單細(xì)胞懸液，然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟中巨噬細(xì)胞的百分比（第0 天為對照組）。另取小鼠進(jìn)行GW2580 干預(yù)炎癥反應(yīng)的研究（n=9），將小鼠分為3 組，即正常對照組、LPS 組和GW2580+LPS 組，每組各3 只。正常對照組不予藥物處理；LPS 組予腹腔注射LPS，16 h 后處死小鼠；GW2580+LPS 組,小鼠首先進(jìn)行1 周的GW2580 灌胃，在第8 天時(shí)予腹腔注射LPS，16 h 后處死小鼠。

2.標(biāo)本獲?。河捎谛∈篌w內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)生較快，故于建模后16 h，用注射戊巴比妥鈉的方法麻醉小鼠后，經(jīng)眼球采血法留取外周血，進(jìn)行血清標(biāo)志物的檢測，并用頸椎脫臼法處死小鼠，取其脾臟和腎臟組織。處死前4 h 使用小鼠代謝籠收集尿液標(biāo)本。

3.小鼠血及尿指標(biāo)檢測：小鼠外周血標(biāo)本在室溫下靜置1 h 后，以2 000 r/min 的速度離心10 min（離心半徑為85 mm），取上層清液。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清中TNF-α 的水平變化。TNF-α 檢測按試劑盒說明書進(jìn)行操作，即將TNF-α 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品依次加入包被的微孔板中，每孔100 μL；室溫下孵育2 h，洗滌后加入檢測抗體，孵育結(jié)束后依次加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶、顯色底物以及終止液，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度值。另取離心后的血清，檢測其中的肌酐和尿素氮水平，評估小鼠腎功能。采用干化學(xué)分析法（尿液試紙條）進(jìn)行小鼠尿紅細(xì)胞和尿蛋白的檢測，若尿液中存在蛋白質(zhì)或血紅蛋白，則試紙條變將出現(xiàn)顏色變化。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測：因脾臟中的巨噬細(xì)胞數(shù)量較為豐富，所以選擇小鼠的脾臟進(jìn)行GW2580 耗竭巨噬細(xì)胞效果的檢測。將小鼠脾臟組織去除表面包膜后，研磨成單細(xì)胞懸液，用40 μm 的細(xì)胞過濾篩網(wǎng)去除結(jié)締組織，使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，加入5 μL 小鼠巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物F4/80 的抗體（小鼠F4/80 BB700），在室溫下避光孵育20 min，洗滌、重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

4.小鼠腎臟組織檢測：用生理鹽水從心尖灌注后，取小鼠的腎臟組織，用甲醛常溫固定24 h 后進(jìn)行石蠟包埋，切成2 μm 的薄切片，脫蠟復(fù)水后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，觀察腎臟組織中炎癥細(xì)胞的浸潤情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、GW2580 對小鼠脾臟巨噬細(xì)胞的影響

在GW2580 預(yù)處理實(shí)驗(yàn)中，隨著給藥時(shí)間延長，小鼠的脾臟巨噬細(xì)胞逐漸減少（見圖1）。與處理前相比，第4 天小鼠脾臟細(xì)胞中巨噬細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（7.42%比4.78%，P<0.05）。至給藥第7 天，小鼠脾臟巨噬細(xì)胞百分比下降為3.50%，與處理前及第4 天相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

二、耗竭小鼠巨噬細(xì)胞對LPS 誘導(dǎo)小鼠炎癥因子表達(dá)的影響

在基礎(chǔ)狀態(tài)下，小鼠體內(nèi)的TNF-α 水平低于檢測最小值。腹腔注射LPS 后16 h 其血清TNF-α水平明顯升高，達(dá)（126.4±16.47） pg/mL（1 pg/mL=1 ng/L），與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示小鼠體內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。予小鼠GW2580 灌胃1 周后，腹腔注射LPS，16 h 后其血清TNF-α 水平較LPS 處理組明顯下降[低于最低檢測值31.3 pg/mL（1 pg/mL=1 ng/L）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見圖2）。

圖2 GW2580 對LPS 誘導(dǎo)小鼠血清TNF-α 的影響

三、耗竭小鼠巨噬細(xì)胞對LPS 誘導(dǎo)小鼠炎癥損傷的脾臟巨噬細(xì)胞的影響

GW2580 干預(yù)組中，首先給予小鼠為期1 周的GW2580 灌胃，隨后進(jìn)行腹腔注射LPS。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與LPS 組相比，GW2580+LPS 組小鼠脾臟細(xì)胞中巨噬細(xì)胞占總脾臟細(xì)胞的百分比下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（4.15%比8.02%，P<0.05)；與正常對照組相比，差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（4.15%比7.59%，P<0.05）（見圖3）。

圖3 GW2580 對LPS 誘導(dǎo)小鼠脾臟巨噬細(xì)胞的影響

四、耗竭小鼠巨噬細(xì)胞對LPS 誘導(dǎo)小鼠腎臟炎癥損傷的影響

干化學(xué)分析法檢測結(jié)果顯示，GW2580+LPS組、LPS 組及正常對照組這3 組小鼠均未出現(xiàn)血尿和蛋白尿。但與正常對照組相比，LPS 組小鼠的血清肌酐升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（14.3±1.23）μmol/L 比（10.47±0.25）μmol/L，P<0.05]；而LPS 組與GW2580+LPS 組比較，血清肌酐值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（14.3±1.23）μmol/L 比（14.67±0.55）μmol/L，P>0.05]（見圖4）。腎臟病理檢測結(jié)果顯示，LPS 組小鼠腎臟組織間質(zhì)中出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤、腎小管空泡化等改變，而GW2580+LPS 組小鼠腎臟組織的病理損傷較LPS 組明顯減輕，提示GW2580 處理可減輕LPS 誘導(dǎo)小鼠腎臟組織的炎癥細(xì)胞浸潤（見圖5）。

圖5 GW2580 對LPS 誘導(dǎo)小鼠腎臟病理的影響

圖4 GW2580 對LPS 誘導(dǎo)小鼠血清肌酐的影響

討 論

一、炎癥反應(yīng)與腎臟損傷

LPS 是革蘭陰性細(xì)菌外膜的組成部分，參與了機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。目前，LPS 輸注或注射動物模型已被廣泛用于炎癥反應(yīng)的研究中。LPS可激活單核巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)。LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可影響腎臟組織學(xué)形態(tài)。本研究在LPS 誘導(dǎo)的全身炎癥小鼠中觀察到血清TNF-α 水平升高及腎組織炎癥細(xì)胞浸潤增多、腎小管受損等病理改變。此外，相關(guān)研究還表明，LPS 可使腎組織出現(xiàn)通透性增強(qiáng)、腎間質(zhì)血流量增加等功能改變[6]。在LPS誘導(dǎo)的動物模型中可以觀察到，其細(xì)胞因子改變比人體中的反應(yīng)更快、更激烈[7-8]。因此，本研究在小鼠腹腔注射LPS 16 h 后進(jìn)行血清炎癥因子的檢測，以便于更準(zhǔn)確地對小鼠的全身炎癥反應(yīng)情況進(jìn)行評估。

越來越多的研究表明，巨噬細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)與腎臟損傷有密切聯(lián)系[9-10]。目前，巨噬細(xì)胞浸潤在腎臟疾病中起重要作用的結(jié)論已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)可。巨噬細(xì)胞是固有免疫的重要成分，屬于髓系免疫細(xì)胞，具有較強(qiáng)的可塑性和異質(zhì)性，在不同的微環(huán)境中可具有不同的表型和功能。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，巨噬細(xì)胞可限制炎癥擴(kuò)散、調(diào)節(jié)炎癥的消散、促進(jìn)組織修復(fù)，若機(jī)體存在炎癥持續(xù)狀態(tài)，如炎癥性自身免疫病、慢性炎癥感染等，持續(xù)存在的刺激可驅(qū)動單核細(xì)胞持續(xù)被招募到炎癥部位，并影響骨髓中髓細(xì)胞的輸出[11]。有研究表明，巨噬細(xì)胞在持續(xù)性炎癥狀態(tài)中可促進(jìn)組織纖維化[12]。本研究結(jié)果表明，用GW2580 耗竭小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞后，LPS誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α 的作用受到顯著抑制，腎臟損傷也有明顯的減輕，表明GW2580 可耗竭巨噬細(xì)胞從而抑制炎癥反應(yīng)，對LPS 誘導(dǎo)小鼠腎組織損傷具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果也提示，巨噬細(xì)胞可作為干預(yù)炎癥所致腎臟損傷中的新靶標(biāo)。

二、耗竭巨噬細(xì)胞對局部及全身炎癥損傷的作用

鑒于巨噬細(xì)胞浸潤對腎臟疾病損傷中的作用，越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)向阻斷巨噬細(xì)胞在腎臟的募集，從而達(dá)到減輕腎臟損傷的目的[13]。這些研究主要采用調(diào)節(jié)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞招募過程中的分子靶點(diǎn)、促炎趨化因子等方式進(jìn)行干預(yù)，以達(dá)到減少組織中巨噬細(xì)胞浸潤，從而減輕組織損傷的效果。如部分研究采用了選擇素特異性中和抗體[14]、CCL2/MCP-1 中和抗體或者截短的CCL2/MCP-1 肽類似物 （MCP-19-76）[15]、CCL5/RANTES 類似物進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果在多種腎臟炎癥模型中均發(fā)現(xiàn)腎臟組織中浸潤的巨噬細(xì)胞顯著減少及蛋白尿的改善。可見，以巨噬細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行干預(yù)治療，對減輕腎臟炎癥反應(yīng)以及緩解腎組織損傷具有積極意義。

本研究采用LPS 誘導(dǎo)建立小鼠炎癥模型，并采用GW2580 耗竭巨噬細(xì)胞。GW2580 可選擇性作用于巨噬細(xì)胞表面的選擇性集落刺激因子1 受體，以發(fā)揮生物學(xué)活性。本研究采用的化合物GW2580 作為巨噬細(xì)胞耗竭劑已在多種疾病模型 （如帕金森病、脊髓損傷、佐劑性關(guān)節(jié)炎等[16-18]）中得到應(yīng)用，但GW2580 在腎臟疾病中的應(yīng)用目前少有報(bào)道。相關(guān)研究表明，腎臟組織中巨噬細(xì)胞浸潤與腎臟損傷密切相關(guān)[19]，在腎臟炎癥性疾病中，組織中浸潤的單核巨噬細(xì)胞可能是一個(gè)潛在的干預(yù)靶點(diǎn)，減少巨噬細(xì)胞可抑制炎癥在腎臟中的發(fā)展。本研究使用GW2580 耗竭巨噬細(xì)胞，連續(xù)給藥1 周可達(dá)到明顯的巨噬細(xì)胞耗竭效果。在此基礎(chǔ)上，在LPS 誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型中應(yīng)用GW2580 干預(yù)后，小鼠體內(nèi)的炎癥因子表達(dá)下降，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤減輕。本研究中LPS 組與GW2580+LPS 組間的血肌酐水平無差異，但均比對照組有所升高，推測由于LPS 對腎臟損傷可表現(xiàn)在間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤及腎小管損傷，GW2580 耗竭巨噬細(xì)胞雖可改善間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，但該作用短期內(nèi)無法改善腎臟的整體功能。

總之，本研究證實(shí)GW2580 可有效減少炎癥模型小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞數(shù)量，連續(xù)灌胃1 周可達(dá)到理想的巨噬細(xì)胞耗竭效果；證實(shí)GW2580 可減少體內(nèi)巨噬細(xì)胞，從而顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生，并可減輕腎臟組織炎癥細(xì)胞浸潤，使炎癥反應(yīng)得到有效控制。這為今后進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞在腎臟疾病中的作用打下基礎(chǔ)。