血清天冬酰胺內(nèi)肽酶與急性大動(dòng)脈粥樣硬化型卒中間相關(guān)性的前瞻性研究

戎天藝，花 蕓，陳德艷，何 旻

（上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200438）

卒中是神經(jīng)科最常見的疾病，患者發(fā)病后的神經(jīng)功能缺失癥狀在起病2～3 d 內(nèi)呈漸進(jìn)性加重，稱為早期神經(jīng)功能惡化 （early neurological deterioration,END）[1]，其發(fā)生率高達(dá)13.0%～37.5%[2-3]，常導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損和殘疾，并增加了病死率。目前，END 的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，其發(fā)病機(jī)制可能與炎性反應(yīng)[4]、血栓進(jìn)展[5]、腦水腫[6-7]、出血轉(zhuǎn)化[8]、癲癇發(fā)作[9]等有關(guān)。

眾所周知，大動(dòng)脈粥樣硬化（large-artery atherosclerosis，LAA）性狹窄是導(dǎo)致卒中發(fā)生的主要原因[10]，且在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中，炎癥因子發(fā)揮著重要作用[11]。既往研究較多關(guān)注基質(zhì)金屬蛋白酶、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等。有研究提示，天冬酰胺內(nèi)肽酶（legumain，LGMN）在炎性反應(yīng)過程中起抗原呈遞作用。LGMN 是近年發(fā)現(xiàn)的一類新型半胱氨酸蛋白酶，其作為一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，只在特定條件下表達(dá)。LGMN 在哺乳類動(dòng)物體內(nèi)具有抗細(xì)胞凋亡作用，在炎癥反應(yīng)過程中起抗原呈遞作用，能夠抑制骨質(zhì)鈣化，同時(shí)其在轉(zhuǎn)移或浸潤的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)[12]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（尤其是在不穩(wěn)定斑塊）中LGMN 的水平上調(diào)，且其水平與頸動(dòng)脈及主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)[13-14]。可見，LGMN水平與END 風(fēng)險(xiǎn)間是否相關(guān)，值得研究。本研究就急性LAA 型卒中患者的LGMN 水平與END 間的關(guān)系進(jìn)行研究，以期為臨床早期識(shí)別END 提供參考。

資料與方法

一、資料

本研究連續(xù)納入2016 年1 月1 日至2018 年12 月31 日間上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科病房收治的卒中患者，納入標(biāo)準(zhǔn)為滿足如下所有條件。①起病時(shí)間在72 h 內(nèi)；②年齡大于18 歲；③符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[15]，經(jīng)頭顱CT 或頭顱MRI 檢查證實(shí)為卒中，發(fā)病前無明顯肢體殘疾，且改良Rankin 量表 （modified Rankin Scale,mRS）評(píng)分≤1 分；④有頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)和（或）椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)癥狀和體征；⑤TOAST （Trial of ORG 10 172 in Acute Stroke Treatment） 分型[16]為LAA 型；⑥經(jīng)頭頸部CT 血管成像（CT angiography,CTA）檢查證實(shí)腦動(dòng)脈狹窄>50%。END 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為入院3 d 內(nèi)任意時(shí)間點(diǎn)復(fù)評(píng)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分較入院時(shí)增加≥2 分[16]。同時(shí)，排除具有以下任一情況者。①TOAST 分型為其他類型的卒中；②合并其他系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病，如急性冠脈綜合征、惡性腫瘤、全身感染性疾病、自身免疫病、嚴(yán)重肝和（或）腎功能障礙等；③近期應(yīng)用抗凝藥物、靜脈溶栓或血管內(nèi)治療的患者；④正在服用免疫抑制劑或激素；⑤處于孕期或哺乳期。具體流程見圖1，最終有334 例LAA 型卒中患者被納入本研究。

圖1 研究對(duì)象納入和排除流程圖

本研究獲得上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者或家屬均已簽署知情同意書。

二、方法

1.基線資料收集：收集所有研究對(duì)象的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息（年齡、性別）、卒中危險(xiǎn)因素（高血壓、糖尿病、高血脂、心房顫動(dòng)、身高、體重、吸煙、飲酒）、基線血壓以及血液檢查結(jié)果 （包括超敏C 反應(yīng)蛋白、空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇，國際標(biāo)準(zhǔn)化比值、D-二聚體）。所有患者均行頸動(dòng)脈超聲檢查，根據(jù)超聲特征將斑塊分為穩(wěn)定斑塊（強(qiáng)回聲鈣化斑塊）和易損斑塊（低回聲、等回聲及混合回聲斑塊）。

2.血清學(xué)檢查：所有患者均于入院次日清晨空腹抽取靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，行3 000 r/min 離心15 min（離心半徑為10 cm），分離血清后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。所有血標(biāo)本均無溶血。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法測定LGMN（μg/L）水平。人LGMN ELISA 試劑盒購自美國RayBiotech公司。

3.影像學(xué)檢查：根據(jù)患者的頭顱MRI 或頭顱CT 的影像學(xué)特征，結(jié)合臨床表現(xiàn)，明確此次發(fā)病的責(zé)任病灶。前循環(huán)梗死病灶位于頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈或大腦前動(dòng)脈供血區(qū)，后循環(huán)梗死病灶位于基底動(dòng)脈、椎動(dòng)脈或大腦后動(dòng)脈供血區(qū)。采用頭頸部CTA 檢查對(duì)腦血管進(jìn)行評(píng)價(jià)。腦血管的狹窄率范圍在50%～70%為中度狹窄；狹窄率范圍在70%～99%（不包括70%）為重度狹窄；狹窄率＞99%為閉塞。采用頭顱MRI 檢查以及血管評(píng)估來判斷患者的TOAST 分型是否為LAA。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料以±s 表示，2 組間采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗(yàn)。非正態(tài)分布連續(xù)變量采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（IQR）]表示，2 組間采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多變量Logistic 回歸分析確定END 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，采用受試者操作特征（receiver operator characteristic,ROC）曲線進(jìn)一步研究血清LGMN 對(duì)END 的預(yù)測價(jià)值。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基線資料

本研究的334 例急性LAA 型卒中患者中，有78 例（23.4%）發(fā)生END（作為END 組），平均年齡為（72.8±9.7）歲，其中有69.2%的梗死病灶位于前循環(huán)。另256 例入院3 d 內(nèi)未發(fā)生END 的患者作為非END 組。在人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征方面，2 組間的年齡、性別相仿（P>0.05）（見表1）。在血管危險(xiǎn)因素方面，END 組患者合并高血壓、糖尿病、高血脂、存在易損斑塊的比例較非END 組高（P 均<0.01）。在臨床特征方面，END 組患者的入院收縮壓、入院卒中癥狀嚴(yán)重程度（入院NIHSS 評(píng)分）以及血清LGMN、空腹血糖、糖化血紅蛋白、超敏C 反應(yīng)蛋白水平均顯著高于非END 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P 均<0.05）（見表1）。

二、影響END 因素的多因素Logistic 回歸分析

以表1 中P<0.1 的變量作為自變量，納入分類變量（高血壓、糖尿病、高血脂、易損斑塊及顱內(nèi)血管狹窄程度），連續(xù)變量（入院收縮壓、LGMN、空腹血糖、糖化血紅蛋白及入院NIHSS 評(píng)分），以是否發(fā)生END 作為因變量，進(jìn)行非條件二分類Logistic 回歸分析顯示，血清LGMN 水平升高[優(yōu)勢比（odds ratio，OR）=1.309，95%置信區(qū)間 （confidence interval，CI）為1.188～1.441，P<0.001]是發(fā)生END 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其他危險(xiǎn)因素還包括易損斑塊存在及入院收縮壓水平、糖化血紅蛋白水平、入院NIHSS 評(píng)分（見表2）。

表2 影響END 發(fā)生因素的Logistic 回歸分析

表1 END 組與非END 組資料比較

三、血清LGMN 預(yù)測LAA 型卒中患者發(fā)生END 的ROC 曲線分析

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清LGMN 預(yù)測END 的曲線下面積為0.715（95%CI 為0.663～0.763，P＜0.001），此時(shí)最佳臨界值為6.73 μg/L，預(yù)測END的靈敏度為64.1%，特異度為81.3%，陽性預(yù)測值為51.0%，陰性預(yù)測值為88.1%（見圖2）。

圖2 血清LGMN 預(yù)測LAA 型卒中患者發(fā)生END 的ROC 曲線

四、END 組顱內(nèi)血管不同程度狹窄組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

在END 患者中，中度狹窄組及閉塞組的血清LGMN 水平顯著低于重度狹窄組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.04）（見表3）。3 組患者的空腹血糖、超敏C反應(yīng)蛋白、D-二聚體、膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、糖化血紅蛋白水平以及國際標(biāo)準(zhǔn)化比值差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表3 END 組顱內(nèi)血管不同程度狹窄組的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

討 論

LGMN 是一類新型半胱氨酸蛋白酶，作為一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，其在特定條件下表達(dá)，并可影響細(xì)胞外基質(zhì)重塑從而影響粥樣硬化病變的進(jìn)展及斑塊的穩(wěn)定性。LGMN 可激活其他蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶2、組織蛋白酶L 和纖連蛋白[17-19]。既往幾項(xiàng)研究報(bào)道了LGMN mRNA 和蛋白在頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定區(qū)域中的表達(dá)上調(diào)，提示LGMN 在不穩(wěn)定斑塊中的作用[12,14,20]。Umei 等[21]研究報(bào)道了伴有復(fù)雜冠狀動(dòng)脈病變的冠心病患者血漿LGNM 水平明顯高于無復(fù)雜病變的冠心病患者以及無冠心病者。血漿高LGMN 水平是復(fù)雜冠狀動(dòng)脈病變相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在挪威的一項(xiàng)研究中，頸動(dòng)脈狹窄的患者血漿LGMN 水平明顯高于健康對(duì)照組，但頸動(dòng)脈狹窄程度與LGMN 的水平無相關(guān)性[22]。

在本研究中，END 組卒中患者的血清LGMN水平高于非END 組，提示LGMN 是預(yù)測END 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。調(diào)整高血壓、糖尿病等混雜因素后，血清LGMN 水平升高仍是END 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步進(jìn)行ROC 曲線分析，結(jié)果顯示，LGMN預(yù)測END 的曲線下面積為0.715，此時(shí)最佳臨界值為6.73 μg/L，靈敏度為64.1%，特異度為81.3%，提示LGMN 對(duì)LAA 型卒中患者發(fā)生END 有一定預(yù)測價(jià)值，聯(lián)合其他指標(biāo)如超敏C 反應(yīng)蛋白可能有更高的預(yù)測價(jià)值。故在今后的臨床工作中，可考慮檢測LAA 型卒中患者的血LGMN 水平以助于早期發(fā)現(xiàn)易發(fā)生END 的人群，從而進(jìn)行早期干預(yù)，改善患者的預(yù)后。筆者推測，高LGMN 水平可引起動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥加重，使其不穩(wěn)定而更易破裂，這可能是LAA 型急性缺血性卒中患者發(fā)生END 的機(jī)制之一。另外本研究結(jié)果顯示，顱內(nèi)血管重度狹窄患者的血清LGNM 水平明顯高于中度狹窄及閉塞患者，這可能與斑塊不穩(wěn)定有關(guān)。

本研究有如下不足。首先，他汀類藥物可能對(duì)血漿LGMN 水平有影響。Wang 等[23]報(bào)道了經(jīng)過12 周阿托伐他汀治療40 例冠心病患者，其單核細(xì)胞中LGMN mRNA 的表達(dá)下降。本研究中，有20.4%的患者在發(fā)病前服用了他汀類藥物，因而本研究的結(jié)果可能存在干擾。其次，本研究未評(píng)估血清LGMN 活性形式，LGMN 合成分子相對(duì)分子質(zhì)量為56 000，而其激活需要裂解成相對(duì)分子質(zhì)量為36 000 的活性形式[24]。由于，目前還沒有ELISA 試劑盒可以檢測LGMN 的活性形式，本研究使用ELISA試劑盒測量的是其前體和活性形式的總水平。最后本研究為單中心回顧性研究，具有地域局限及病例選擇缺乏代表性，且僅納入了334 例患者，樣本量較小，可能對(duì)結(jié)果有影響。最后，本研究僅分析了TOAST 亞型為LAA 型的急性缺血性卒中患者，今后可擴(kuò)大樣本，進(jìn)一步研究血LGMN 水平與其他亞型急性缺血性卒中患者發(fā)生END 間的關(guān)系。

總之，急性LAA 型卒中患者的血LGMN 水平與END 發(fā)生密切相關(guān)，可能成為預(yù)測END 的新型生物標(biāo)志物。