重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展

王亞楠，陳昌國

1河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北張家口 075000；2解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，北京 100048

自聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)發(fā)明以來，分子檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、個體化診療、遺傳分析等領(lǐng)域[1-3]。目前一代PCR、熒光定量PCR及新興的數(shù)字PCR技術(shù)均需要專用儀器的支持以完成檢測，在一些沒有專用儀器的場景不能很好地發(fā)揮核酸檢測的作用。20世紀(jì)90年代初，有學(xué)者嘗試研發(fā)不依賴于復(fù)雜升降溫儀器的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)，其簡化的擴(kuò)增條件在很大程度上降低了對復(fù)雜儀器的依賴，為資源匱乏地區(qū)及實(shí)驗(yàn)室外的現(xiàn)場檢測提供了新的技術(shù)手段。作為核酸恒溫擴(kuò)增的重要一員，重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)技術(shù)曾被認(rèn)為可替代PCR技術(shù)。本文就RPA的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)簡述

目前已研發(fā)出的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、鏈替代擴(kuò)增(strand displacement amplification，SDA)、滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification，RCA)、依賴解旋酶的恒溫基因擴(kuò)增(helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)、轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(transcription-based amplification system，TAS)、依賴核酸序列的擴(kuò)增(nuclear acid sequence-based amplification，NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(transcription mediated amplification，TMA)、RPA等。不同核酸擴(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)及優(yōu)缺點(diǎn)如表1－2所示。

表1 不同核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)Tab.1 Characteristics of different techniques for nucleic acid isothermal amplification

表2 不同核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)Tab.2 Merits and demerits of different techniques for nucleic acid isothermal amplification

RPA由英國TwistDx Inc公司于2006年成功開發(fā)[4]。雖然RPA恒溫擴(kuò)增法創(chuàng)立較晚，但其發(fā)展速度較快。與其他恒溫擴(kuò)增技術(shù)相比，R PA可在23～45 ℃條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，最適溫度為37～42 ℃，不需要熱變性，在常溫下即可完成擴(kuò)增過程，核酸擴(kuò)增速度較快，可在20 min內(nèi)獲得目的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且不需要溫控設(shè)備，可真正實(shí)現(xiàn)便攜式快速核酸檢測。RPA因其使用相對簡單，與其他恒溫擴(kuò)增方法相比具有更高的敏感性、特異性以及不需要起始加熱、可以使用多重引物等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。

2 RPA技術(shù)的原理

RPA技術(shù)主要依賴于能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的T4噬菌體來源的重組酶T4UvsX、單鏈結(jié)合蛋白(single-stranded binding protein，SSB)和鏈置換DNA聚合酶等，以上三種物質(zhì)的混合物在常溫下均有活性，最佳反應(yīng)溫度為37 ℃左右。如圖1所示，重組酶在ATP的參與和定位因子(T4UvsY)的幫助下與擴(kuò)增引物結(jié)合形成重組酶引物復(fù)合體，并在雙鏈DNA中尋找同源序列，一旦定位到同源序列，重組酶引物復(fù)合體會插入雙鏈DNA形成D-環(huán)結(jié)構(gòu)，啟動鏈置換反應(yīng)，SSB蛋白與解開的DNA鏈結(jié)合防止進(jìn)一步被置換。同時，重組酶從重組酶引物復(fù)合體中被水解，3'端引物暴露并與DNA聚合酶結(jié)合，DNA開始復(fù)制延伸，最終兩條母鏈分離，形成兩條新的互補(bǔ)雙鏈DNA，實(shí)現(xiàn)對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。在整個過程中，重組酶引物復(fù)合體的形成是影響D-環(huán)結(jié)構(gòu)形成速率的關(guān)鍵[5]，在重組酶完全包覆引物但尚未與雙鏈DNA結(jié)合時D-環(huán)結(jié)構(gòu)形成速率最高[6]。SSB蛋白和T4UvsY(連同ATP)是T4UvsX蛋白和鏈置換反應(yīng)發(fā)生的必備條件[6-8]，然而，當(dāng)這兩種蛋白同時存在時，T4UvsX蛋白的濃度需要比僅存在其中一種時更高[5,9-10]。當(dāng)T4UvsX蛋白降解時，SSB蛋白可刺激鏈置換反應(yīng)的發(fā)生[9]，而T4UvsY蛋白可防止SSB蛋白與T4UvsX蛋白對引物結(jié)合位點(diǎn)的相互競爭，避免SSB蛋白在起始就與引物結(jié)合。當(dāng)引物濃度降低時，SSB蛋白抑制T4UvsX蛋白的鏈置換活性；T4UvsY蛋白增多時，可能侵入SSB蛋白包覆的引物中，促進(jìn)T4UvsX蛋白與引物結(jié)合，從而取代引物上的SSB蛋白[11]。

圖1 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)原理Fig.1 Principles of recombinase polymerase amplification

3 RPA體系

3.1 引物與探針 引物設(shè)計是核酸擴(kuò)增反應(yīng)的重要一環(huán)。然而，目前尚無專門的軟件用于RPA引物設(shè)計。通常情況下，RPA使用的引物較PCR引物長，設(shè)計引物時長度最少30個堿基，32～35個堿基的引物最為常用。有研究報道，普通PCR引物可用于RPA擴(kuò)增并獲得有效的擴(kuò)增產(chǎn)物，但大于45個堿基的較長引物由于易形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響擴(kuò)增效率而不推薦使用[12]。與PCR引物設(shè)計的原則相同，設(shè)計RPA引物時亦要避免大量的回文結(jié)構(gòu)及過高或過低的G、C含量(<30%或>70%)，引物5'端避免出現(xiàn)多個G，3'端應(yīng)盡量含有G、C。RPA反應(yīng)擴(kuò)增靶序列長度一般在80～400 bp，最長可擴(kuò)增1.5 kb的長序列，以100～200 bp靶序列的擴(kuò)增效果最佳[13]。

在進(jìn)行RPA實(shí)時檢測(RT-RPA)時，可使用exo探針或fpg探針。前者是含有46～52個堿基的長寡核苷酸，在熒光基團(tuán)和淬滅劑之間有堿基被四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)替代且呈結(jié)合狀態(tài)，當(dāng)探針與靶序列結(jié)合時，該位點(diǎn)被裂解，熒光基團(tuán)與淬滅劑分離使得熒光信號釋放，5～10 min即可檢測到陽性熒光信號。此外，被裂解的exo探針產(chǎn)生的游離3'端可作為一個正向引物被聚合酶延長[14]。與exo探針相比，fpg探針更短，長度為32～35個堿基，其淬滅劑在5'端，熒光基團(tuán)位于淬滅劑5～6個堿基之后，是通過C-O-C鍵連接的脫氧核糖(deoxyribose，dR)熒光基團(tuán)。fpg是一種8-羥基DNA糖苷酶，可識別并裂解dR熒光基團(tuán)，但其生成的游離3'端不可作為引物被聚合酶延長。在進(jìn)行RPA側(cè)流層析(RPALF)檢測時，通常使用nfo探針，該探針與exo探針識別位點(diǎn)(THF)相同，產(chǎn)生的信號低且切割不完全，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的降解，且其裂解后產(chǎn)生的游離3'端可作為引物被延長；該探針也可用于凝膠電泳檢測。研究發(fā)現(xiàn)，與nfo探針相比，exo探針具有更高的靈敏度，但會導(dǎo)致核酸外切酶降解DNA，故不能用于瓊脂糖凝膠電泳[15]。

3.2 溫度與混合對反應(yīng)的影響 適宜的反應(yīng)溫度是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素之一。RPA反應(yīng)的推薦溫度為37～42 ℃[12]，有研究顯示其最大反應(yīng)溫度范圍可在15～50 ℃，而得到陽性擴(kuò)增結(jié)果的反應(yīng)溫度一般均大于30 ℃[16]，少數(shù)學(xué)者在25 ℃時利用RPA擴(kuò)增技術(shù)與側(cè)流層析試紙條(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick，RPA-LFD)結(jié)合的方法得到了陽性結(jié)果[17]。由于沒有復(fù)雜溫控模塊的存在，環(huán)境溫度的變化可影響RPA的擴(kuò)增效果，當(dāng)周圍環(huán)境溫度不穩(wěn)定時，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間以提高檢出率[18]。

除溫度的影響外，RPA較小的反應(yīng)體系中含有多種酶和引物，從而導(dǎo)致整個反應(yīng)體系較為黏稠，特別是試劑混合后黏滯性增加可影響低拷貝靶序列的擴(kuò)增效率，有學(xué)者建議在RPA反應(yīng)開始時即對反應(yīng)體系進(jìn)行攪拌混勻以加快RPA反應(yīng)速率和提高反應(yīng)靈敏度。如果反應(yīng)混合條件有限，也可將反應(yīng)液的總體積減少至5 μl，以省去混合步驟，較小的體積可增強(qiáng)擴(kuò)增時試劑與寡核苷酸的相互作用，從而提高反應(yīng)效率[19]。

3.3 錯配、抑制劑及背景DNA對反應(yīng)的影響 成功的RPA反應(yīng)除需要考慮引物與探針設(shè)計的內(nèi)在影響，還需要考慮外部溫度、體系混勻的控制及對錯配、抑制劑和背景DNA的耐受性。有研究發(fā)現(xiàn)，錯配發(fā)生在引物5'端或中心時對RPA反應(yīng)影響輕微，但當(dāng)錯配發(fā)生在引物3'端時對RPA反應(yīng)影響明顯[20]。這與RPA反應(yīng)的機(jī)制有關(guān)，如上所述，RPA反應(yīng)從引物3'端開始復(fù)制擴(kuò)增，因此可利用3'端的錯配敏感性鑒別單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)。一般認(rèn)為，除引物3'端外，RPA錯配耐受性是有利的，對于高度多態(tài)性的靶標(biāo)，可使引物設(shè)計具有一定的靈活性；相反，這種錯配耐受性也會造成相似物種間的非特異性擴(kuò)增，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在樣品制備和處理過程中會出現(xiàn)或引入一些類似抑制劑作用的物質(zhì)而干擾核酸的正常擴(kuò)增。有研究證實(shí)，RPA反應(yīng)可在部分抑制劑存在的情況下進(jìn)行：20 g/L血紅蛋白、0.5 U肝素以及1.25%尿液不會影響RPA反應(yīng)；50 g/L血紅蛋白、4%(V/V)乙醇、5%尿液對RPA反應(yīng)僅有輕微影響；0.05%(V/V)十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、10%尿液可完全抑制RPA反應(yīng)[21-23]。DNA模板濃度與抑制劑的抑制作用呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)DNA模板用量為10 pg時，抑制劑的抑制作用會減輕，而當(dāng)DNA模板濃度降低至接近檢測限時，抑制劑對RPA反應(yīng)的抑制作用更明顯[21-23]。培養(yǎng)介質(zhì)的使用也會在制備樣本時引入影響因素，當(dāng)使用亞硒酸胱氨酸肉湯作為增菌液時，大量的引物二聚體可導(dǎo)致RPA-LFD檢測結(jié)果呈假陽性[24]。在常規(guī)抑制劑的存在下，RPA反應(yīng)通常具有較好的穩(wěn)定性，這有利于粗提樣品的擴(kuò)增，是使用普通PCR方法較難實(shí)現(xiàn)的。

除可耐受抑制劑，RPA還能夠在背景DNA存在的情況下擴(kuò)增目標(biāo)核酸，與對抑制劑的耐受性類似，RPA對背景DNA的耐受性也呈濃度依賴性。Clancy等[25]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)背景DNA含量為400 ng時，RPA反應(yīng)受到明顯抑制；當(dāng)背景DNA含量降低至200 ng時，RPA反應(yīng)受到的抑制作用隨之減輕。另外，Rohrman等[26]指出，RPA反應(yīng)體系中所使用的引物、探針以及靶序列的選擇均可影響其自身對背景DNA的耐受。

3.4 RPA技術(shù)的檢測方法 PCR的檢測方法也可用于RPA，如實(shí)時熒光檢測、側(cè)向?qū)游龊湍z電泳。RPA反應(yīng)的結(jié)果可根據(jù)使用探針的不同，采用不同的方法讀取。傳統(tǒng)的TaqMan探針不能用于實(shí)時RPA檢測，PCR Taq聚合酶也不可與擴(kuò)增系統(tǒng)共存。Taq聚合酶的5'→3'核酸外切酶活性在鏈置換過程中可逐漸消化置換鏈，從而抑制DNA的擴(kuò)增，因此RT-RPA常選用exo探針和fpg探針。側(cè)向?qū)游龇ù蠖嘁詎fo探針和金納米作為示蹤劑直接使用擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行夾心檢測，但建議在進(jìn)行條帶檢測前用緩沖液稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物以避免產(chǎn)生虛帶。使用凝膠電泳檢測RPA結(jié)果時，由于試劑及蛋白易形成復(fù)合物，影響電泳條帶的遷移，可選用加熱(65 ℃下10 min)變性、去垢劑(SDS)處理、酶(蛋白酶K)消化、高速離心沉淀蛋白等方法消除影響[27-28]。與實(shí)時熒光檢測相比，層析檢測的成本較低，更適用于資源匱乏地區(qū)。

除以上常用方法外，橋聯(lián)絮凝分析、比色反應(yīng)、電化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)、電化學(xué)生物傳感器、硅微環(huán)諧振器(SMR)光子檢測和表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)檢測等方法也可與RPA結(jié)合以實(shí)現(xiàn)快速檢測。橋聯(lián)絮凝分析法是一種無需設(shè)備、只需裸眼觀察即可得出結(jié)果的方法，更適用于低資源配置地區(qū)。該方法依賴于羧基官能化磁珠的可逆絮凝，絮凝程度主要取決于鹽濃度、pH值以及DNA的長度(最小為100 bp)。在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入納米磁珠后呈現(xiàn)絮凝狀態(tài)，經(jīng)過乙醇洗脫后，在低pH的緩沖液中，磁珠溶液可再次呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)，如果磁珠溶液仍處于絮凝狀態(tài)，則可判斷結(jié)果為陽性[29]。RPA反應(yīng)可通過比色反應(yīng)進(jìn)行終點(diǎn)判讀，生物素修飾的引物或脫氧核苷酸(dNTPs)均可用于產(chǎn)生被標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后加入辣根過氧化物酶(HRP)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、過氧化氫酶即可產(chǎn)生顏色變化，其強(qiáng)度與擴(kuò)增子濃度呈比例關(guān)系。利用電化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)檢測RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的方法是通過捕獲由酶標(biāo)探針和表面固定互補(bǔ)探針?biāo)a(chǎn)生的擴(kuò)增子的單鏈DNA來進(jìn)行檢測[30]，也可用經(jīng)磁珠和金納米顆粒分別標(biāo)記的正向引物和反向引物進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用磁鐵將該雙標(biāo)記產(chǎn)物捕獲到工作電極，利用析氫反應(yīng)可檢測金納米顆粒，進(jìn)一步檢測擴(kuò)增產(chǎn)物[31]。另外，RPA聯(lián)合電化學(xué)生物傳感器可檢測植物病原體，用修飾引物產(chǎn)生一端含生物素、另一端含寡核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后與探針互補(bǔ)的且標(biāo)記AuNPs-DNA的序列雜交，用磁珠純化擴(kuò)增子，除去多余試劑，加熱變性擴(kuò)增產(chǎn)物，使AuNPs釋放于溶液中，用差分脈沖伏安法測定AuNPs的含量[32]，其含量與擴(kuò)增產(chǎn)物呈正比。RPA反應(yīng)還可利用SMR光子檢測，核酸在逐漸衰減的諧振器波導(dǎo)中以不對稱方式進(jìn)行擴(kuò)增，核酸與引物結(jié)合誘導(dǎo)了波導(dǎo)表面近端折射率的變化，隨著核酸不斷擴(kuò)增，波長偏移可在SMR上實(shí)時監(jiān)測到[33]。由于每個波長的偏移都是在單獨(dú)的硅微環(huán)上檢測的，與多重實(shí)時熒光檢測相比，該方法減輕了熒光基團(tuán)光譜重疊造成的信號干擾。該方法無需標(biāo)記熒光，敏感性較高，可作為實(shí)時熒光檢測的替代方法。SERS已被用于RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，其原理是納米級金屬表面被激光激發(fā)時，由于共振驅(qū)動表面電荷運(yùn)動，產(chǎn)生一個高度局部化光場，當(dāng)分子靠近該增強(qiáng)場時，拉曼信號明顯增強(qiáng)。SERS靈敏度較高，Lau等[34]使用該方法檢測三種植物病原菌并證實(shí)其敏感性分別是RPA瓊脂凝膠電泳和PCR瓊脂凝膠電泳的100倍和1000倍。

4 RPA技術(shù)的應(yīng)用

RPA技術(shù)可用于不同種類的目標(biāo)生物檢測，如細(xì)菌、真菌、病毒、原生動物等的雙鏈DNA、單鏈DNA、甲基化DNA以及通過RNA或miRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA等核酸樣本。

4.1 細(xì)菌、真菌及耐藥基因檢測 由于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)費(fèi)時費(fèi)力且易被雜菌污染，RPA技術(shù)在細(xì)菌檢測方面顯示出極大優(yōu)勢。大腸埃希菌是人體腸道中的正常菌群，但當(dāng)人類誤食被病原菌污染的食物時，會引發(fā)嚴(yán)重的腸炎及腹瀉，劉婧文等[35]利用exo探針使用RT-RPA在37 ℃下于20 min內(nèi)完成了對大腸埃希菌的定性，但前期需進(jìn)行9 h的增菌，與傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)法相比，檢測時間大幅縮短，且最低檢測限可達(dá)0.01 ng/μl，為臨床快速診斷提供了技術(shù)支持。單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種人畜共患病原菌，主要感染免疫力低下的人與動物群體，周紅蕾等[36]使用優(yōu)化后的RPA反應(yīng)體系，在42 ℃下于15 min內(nèi)應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢出該病原菌，其基因組DNA和菌液的最低檢測限分別為3×102拷貝/μl和103cfu/ml，且對人工污染該菌的樣本使用RPA與qPCR檢測，結(jié)果一致。此外，其他常見細(xì)菌如幽門螺桿菌[37]、鏈球菌[38]等的RPA檢測皆有報道。霍亂在我國被列為甲類傳染病，致病菌為霍亂弧菌，由于飲食習(xí)慣，我國南方每年都須進(jìn)行霍亂防控，并需對水生生物進(jìn)行衛(wèi)生防疫。蔣麗婷等[39]利用RT-RPA技術(shù)建立了一種快速檢測霍亂弧菌的方法，其靈敏度達(dá)到0.1 ng/μl，與RT-PCR相當(dāng)，該結(jié)果與傳統(tǒng)增菌法檢測結(jié)果完全一致。柱狀黃桿菌是一種可引起眾多淡水魚發(fā)生嚴(yán)重疾病的病原菌，雖然已經(jīng)建立了多種檢測方法，但仍需開發(fā)一種適用于現(xiàn)場檢測的技術(shù)。Mabrok等[40]運(yùn)用RPA-LFD方法在37 ℃下擴(kuò)增30 min檢測到柱狀黃桿菌，比傳統(tǒng)PCR技術(shù)速度快4倍。小麥全蝕病菌感染是小麥低產(chǎn)的重要因素，嚴(yán)重時可導(dǎo)致小麥大面積死亡。鞠玉亮等[41]使用RPA-LFD技術(shù)建立了一種可快速檢測小麥全蝕病菌的方法，其基因組DNA的檢出限為10 pg/μl，這對小麥全蝕病的早期預(yù)防有重要意義。RPA技術(shù)在真菌檢測方面也有突破，如Meng等[42]比較了PCR、RT-PCR、RT-RPA三種方法檢測念珠菌的效率，結(jié)果顯示，RT-RPA檢測時間最短，為35 min，但其陽性檢出率略低于PCR；Ma等[43]使用RPA-LFD方法對隱球菌感染患者的標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其特異度和靈敏度分別達(dá)到95.2%和95.8%，可用于臨床早期診斷。

RPA還可用于細(xì)菌耐藥基因的檢測。某些革蘭陰性桿菌因?yàn)楹行碌吕锝饘脔０访?New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)而對多種抗生素耐藥，Wang等[44]使用RT-RPA方法檢測了該耐藥基因，同時與PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢出率完全一致。馬骉等[45]運(yùn)用RPA-LFD技術(shù)對動物源性的三種大腸埃希菌磺胺類耐藥基因進(jìn)行同步快檢，檢測限可達(dá)103拷貝/μl，且無交叉反應(yīng)。

4.2 病毒檢測 2 0 1 9 年1 2 月，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)開始出現(xiàn)后，疫情在世界范圍內(nèi)蔓延，目前SARS-CoV-2感染的診斷主要依靠反轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)檢測病毒RNA。Behrmann等[46]運(yùn)用RT-RPA技術(shù)建立了快速篩查的檢測體系，最快7 min即可獲得高濃度的RNA，檢測時間為15～20 min，與RT-qPCR相比，新開發(fā)的RT-RPA具有100%的實(shí)驗(yàn)診斷靈敏度與特異度，是目前報告檢測SARS-CoV-2最快的方法之一。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)與女性宮頸癌和癌前病變相關(guān)，其早期發(fā)現(xiàn)是預(yù)防宮頸癌的重要手段。Ma等[47]使用RPA方法快速檢測HPV16和HPV18兩種高危型人乳頭瘤病毒，并與TaqMan qPCR方法比較，結(jié)果顯示，兩種方法檢測HPV16和HPV18的一致率分別為97.6%、98.5%，相關(guān)性良好。RT-RPA亦被廣泛應(yīng)用于中東呼吸綜合征冠狀病毒[48]、埃博拉病毒[49]及H7N9禽流感病毒[50]等病毒的檢測。

RPA技術(shù)也可用于動植物類病毒的檢測。犬瘟病毒可引起食肉動物致命性的全身系統(tǒng)性疾病，早期發(fā)現(xiàn)可控制病情的發(fā)展，獲得良好的預(yù)后結(jié)果。Wang等[51]使用RT-RPA方法檢測并通過回歸分析發(fā)現(xiàn)，在40 ℃下3～12 min時即可獲得滿意結(jié)果，應(yīng)用于臨床樣本的檢測時與RT-PCR結(jié)果一致，且RT-RPA的時間閾值(threshold time，TT)與RT-PCR循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)呈線性相關(guān)，其決定系數(shù)R2達(dá)到0.947。番茄黃化曲葉病毒感染番茄后，番茄生長緩慢甚至停滯，結(jié)出的果實(shí)數(shù)量少且小。Wang等[52]使用RPA技術(shù)與納米金探針結(jié)合，在20 min內(nèi)可視化檢測番茄的感染狀況，對番茄黃化曲葉病毒感染具有診斷和預(yù)測價值。

4.3 寄生蟲檢測 寄生蟲病一直是危害人類健康的重要疾病。旋毛蟲是最常見的寄生線蟲之一，主要生活在各種脊椎動物和人類的肌肉中，人類因進(jìn)食含有旋毛蟲幼蟲的生的或未經(jīng)煮熟的肉類而感染。Li等[53]使用RPA-LFD方法在37 ℃下、25 min內(nèi)檢測到實(shí)驗(yàn)室感染小鼠模型組織中的旋毛蟲DNA，敏感性為傳統(tǒng)PCR的10倍，可有效診斷感染。弓形蟲通常寄生于人和動物的有核細(xì)胞內(nèi)，在人體多為隱性感染。Wu等[54]使用RPA-LFD方法對弓形蟲特定基因進(jìn)行檢測，能在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)可視化檢測。作為五大寄生蟲病之一的瘧疾是由瘧原蟲感染引起的嚴(yán)重傳染疾病，其診斷方法主要是顯微鏡鏡檢和免疫學(xué)快速檢測，但一些無癥狀感染者卻無法檢出。為了補(bǔ)充現(xiàn)有的診斷方法，Lalremruata等[55]開發(fā)了RT-RPA檢測瘧原蟲的技術(shù)，對無癥狀感染者的檢出準(zhǔn)確率達(dá)100%，對未處理的血樣標(biāo)本直接進(jìn)行RT-RPA檢測的效率進(jìn)行評估，結(jié)果顯示，診斷準(zhǔn)確度為89%，該方法簡化了測試步驟，可作為臨床瘧原蟲感染的篩查工具。

除以上應(yīng)用外，RPA技術(shù)還可用于癌癥的診斷。在鼻咽癌的快速檢測中，Liu[56]通過鄰位鏈接(proximity ligation assay，PLA)探針融合了RPA與TMA技術(shù)，構(gòu)建了PLA-RPA-TMA方法，可快速檢測腫瘤細(xì)胞釋放到血液中的特異性標(biāo)志物。

5 總結(jié)與展望

PCR是核酸檢測技術(shù)的革命性分水嶺，而核酸恒溫擴(kuò)增被稱為PCR的替代品，RPA由于其溫和的反應(yīng)條件、較短的反應(yīng)時間、較高的檢測靈敏度和特異性受到廣泛關(guān)注。但臨床試驗(yàn)認(rèn)證發(fā)現(xiàn)，脫離實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后，RPA在非密閉環(huán)境下反應(yīng)擴(kuò)增后易產(chǎn)生氣溶膠污染，且反應(yīng)靈敏度降低為標(biāo)準(zhǔn)方法的50%，臨床特異性則多與標(biāo)準(zhǔn)方法一致，表明在某些情況下，RPA反應(yīng)可能誤檢陽性樣本，報告假陰性，但其高特異性不易出現(xiàn)假陽性。RPA技術(shù)至今尚未有現(xiàn)場實(shí)際應(yīng)用的報道，可能與現(xiàn)場無法提取較高質(zhì)量的核酸模板、加樣量不準(zhǔn)確、反應(yīng)體系儲存條件受限及易因氣溶膠造成假陽性等有關(guān)。筆者認(rèn)為，可通過使用合理的快速核酸釋放溶液，結(jié)合微流控技術(shù)來克服現(xiàn)場核酸提取及加樣量控制的問題；試劑可采取微囊、納米囊等方法儲存，使反應(yīng)體系中的酶在常溫下長時間保存且仍有較佳的反應(yīng)活性；在實(shí)驗(yàn)研究中常用RT-RPA、凝膠電泳及RPA-LFD的方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，應(yīng)用于現(xiàn)場檢測時前兩者受到限制，而RPA-LFD技術(shù)與透明封閉容器結(jié)合使用可避免氣溶膠的危害。將核酸快速釋放試劑、RPA反應(yīng)體系及LFD試紙條整合置于特殊設(shè)計的反應(yīng)容器中，通過簡單幾步按鍵操作使核酸擴(kuò)增依序進(jìn)行，最終可通過肉眼透過封閉容器的透明部位直接讀取LFD試紙條結(jié)果，實(shí)現(xiàn)真正的現(xiàn)場快速檢測。

到目前為止，RPA檢測試劑尚未被FDA批準(zhǔn)用于臨床樣本檢測。對于臨床檢驗(yàn)，要求對每一份標(biāo)本的檢測都應(yīng)該準(zhǔn)確且及時，對于檢測技術(shù)，穩(wěn)定更為重要。另外，RPA反應(yīng)物復(fù)雜，雖然該檢測技術(shù)使用的試劑已商業(yè)化，但僅有一家公司出售，其反應(yīng)所需的酶不能單獨(dú)獲得，限制了其進(jìn)一步的研發(fā)。Chen等[57]為解決這一限制，基于一種ProofMan新型探針研發(fā)了重組酶結(jié)合輔助環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增(recombinase assisted loop-mediated amplification，RALA)方法，實(shí)現(xiàn)了簡單、恒溫DNA擴(kuò)增，甚至可檢測SNP，但整個技術(shù)方法有待驗(yàn)證。RPA技術(shù)可能不會在未來幾年取代PCR的地位，但可與PCR的功能形成互補(bǔ)。目前，RPA仍處于臨床及現(xiàn)場測試評估的初期階段，尚未成熟到作為臨床及現(xiàn)場環(huán)境中的常規(guī)測試。隨著RPA技術(shù)的持續(xù)快速發(fā)展，該技術(shù)可能成為功能強(qiáng)大的高效移動核酸檢測方法。