血流感染細(xì)菌快速鑒定及藥敏試驗(yàn)的方法學(xué)評(píng)價(jià)

丁毅偉，吳思敏，韓志海*

1解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100048；2海南省腫瘤醫(yī)院病理科，?？?570312

血流感染是一種嚴(yán)重的全身感染性疾病，發(fā)病率較高，可導(dǎo)致機(jī)體多器官功能障礙，嚴(yán)重者發(fā)生休克甚至死亡[1]。血流感染患者的預(yù)后與有效的抗生素治療起始時(shí)間有關(guān)，若在感染初期開(kāi)始治療，存活率為79.9%，每推遲1h存活率將降低7.6%[2]；而由于缺乏快速的細(xì)菌鑒定和藥物敏感性信息，臨床醫(yī)師常采取經(jīng)驗(yàn)性廣譜抗生素治療，若藥物選擇不恰當(dāng)，會(huì)降低生存率乃至出現(xiàn)較高的病死率[3]。因此，快速檢測(cè)血流感染中的病原菌(如細(xì)菌和真菌等)以降低微生物的抗藥性，以及為臨床提供快速和準(zhǔn)確的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室需要解決的重要問(wèn)題[4-5]。本研究對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本行MALDI-TOF MS鑒定和VITEK 2 Compact藥敏試驗(yàn)，比較快速直接檢測(cè)方法(簡(jiǎn)稱快速法)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法(簡(jiǎn)稱傳統(tǒng)法)的一致性及準(zhǔn)確性，以期對(duì)血流感染病原體快速鑒定及藥敏試驗(yàn)的方法學(xué)做出評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及其來(lái)源 采集2019－2020年解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心門急診及住院患者的血流感染標(biāo)本，按照《臨床微生物實(shí)驗(yàn)室血培養(yǎng)操作規(guī)范衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T503-2017)》進(jìn)行血培養(yǎng)采集標(biāo)準(zhǔn)操作，送至檢驗(yàn)科，置于血培養(yǎng)儀中培養(yǎng)，待血培養(yǎng)報(bào)警后收集陽(yáng)性標(biāo)本。

1.2 主要試劑及儀器 血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(鄭州安圖生物工程股份有限公司)；HB&L微生物培養(yǎng)儀(意大利Alifax HB&L公司)；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)(美國(guó)Bruker-Daltonik公司)；VITEK 2 Compact型全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃公司)。

1.3 快速法與傳統(tǒng)法鑒定試驗(yàn)

1.3.1 快速法鑒定試驗(yàn) 取2 ml血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本置于1.5 ml無(wú)菌EP管中，然后從EP管中取10 μl菌液轉(zhuǎn)種于2 ml HB&L細(xì)菌分析儀培養(yǎng)液瓶中，置于HB&L微生物培養(yǎng)儀中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，當(dāng)菌液濃度達(dá)到

1.5麥?zhǔn)蠞舛群?，? ml陽(yáng)性菌液置于1.5 ml無(wú)菌EP管中，13 000 r/min離心3 min，制備沉淀物。平行制備2份沉淀物，利用MALDI-TOF MS鑒定細(xì)菌。

1.3.2 傳統(tǒng)法鑒定試驗(yàn) 將收集的血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行傳統(tǒng)法培養(yǎng)，接種于血平板培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單個(gè)菌落，利用MALDI-TOF MS鑒定細(xì)菌。

1.4 快速法與傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn)

1.4.1 快速法藥敏試驗(yàn) 當(dāng)上述陽(yáng)性菌液濃度達(dá)到1.5麥?zhǔn)蠞舛群螅? ml置于1.5 ml無(wú)菌EP管中，13 000 r/min離心2 min，制備沉淀物。平行制備2份沉淀物，利用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.4.2 傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn) 選擇培養(yǎng)皿上的待測(cè)菌落，利用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；如需K-B藥敏試驗(yàn)，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行?？焖俜ㄅc傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn)判斷折點(diǎn)均參照CLSI M100-S29文件。

1.5 快速法與傳統(tǒng)法鑒定試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) MALDI-TOF MS細(xì)菌鑒定結(jié)果判讀：鑒定得分≥2.000分表示準(zhǔn)確鑒定到種，1.700～1.999分表示準(zhǔn)確鑒定到屬，<1.700分表示鑒定結(jié)果不可靠。參照ISO20776-2文件判斷快速法與傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的符合率和錯(cuò)誤率，當(dāng)比對(duì)結(jié)果完全滿足可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，則為可接受(表1)。

表1 快速法與傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Judgment criteria for the results of drug sensitivity test of rapid method and traditional method

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Whonet 5.6及Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示。

2 結(jié) 果

2.1 快速法與傳統(tǒng)法鑒定結(jié)果一致率分析 共收集血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本149例。如表2所示，傳統(tǒng)法鑒定出革蘭陽(yáng)性球菌79株、革蘭陰性桿菌70株?？焖俜ㄅc傳統(tǒng)法鑒定相符的革蘭陽(yáng)性球菌75株、革蘭陰性桿菌67株。兩種方法鑒定的一致率為95.3%(142/149)，鑒定革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陰性桿菌的一致率分別為94.9%(75/79)、95.7%(67/709)。

表2 血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本快速法與傳統(tǒng)法鑒定一致率分析Tab.2 Analysis of the consistency rate of rapid method and traditional method in identification of positive blood culture specimen

2.2 快速法與傳統(tǒng)法鑒定革蘭陽(yáng)性球菌的準(zhǔn)確性分析 如表3所示，149例血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中，傳統(tǒng)法鑒定出革蘭陽(yáng)性球菌79株，其中76株(包括2.300～3.000分16株、2.000～2.299分60株)鑒定到種，占96.2%(76/79)；3株鑒定到屬，占3.8%(3/79)。快速法鑒定出革蘭陽(yáng)性球菌75株，其中52株(包括2.300～3.000分10株、2.000～2.299分42株)鑒定到種，占69.3%(52/75)；20株鑒定到屬，占26.7%(20/75)；3株鑒定結(jié)果不可靠，占

表3 快速法與傳統(tǒng)法鑒定革蘭陽(yáng)性球菌的準(zhǔn)確性分析[株(%)]Tab.3 Accuracy analysis of rapid method and traditional method in identification of Gram-positive cocci [n(%)]

4.0%(3/75)。

2.3 快速法與傳統(tǒng)法鑒定革蘭陰性桿菌的準(zhǔn)確性分析 如表4所示，149例血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中，傳統(tǒng)法鑒定出革蘭陰性桿菌70株，其中66株(包括2.300～3.000分29株、2.000～2.999分37株)鑒定到種，占94.3%(66/70)；4株鑒定到屬，占5.7%(4/70)?？焖俜ㄨb定出革蘭陰性桿菌67株，其中63株(包括2.300～3.000分30株、2.000～2.999分33株)鑒定到種，占94.0%(63/67)；3株鑒定到屬，占4.5%(3/67)；1株鑒定結(jié)果不可靠，占1.5%(1/67)。2.4 革蘭陽(yáng)性球菌快速法與傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的符合率和錯(cuò)誤率分析 傳統(tǒng)法共分離出79株革蘭陽(yáng)性球菌，按照葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果符合率統(tǒng)計(jì)，環(huán)丙沙星、莫西沙星、呋喃妥因、利福平4種藥物的一般錯(cuò)誤率均≤10.0%。氯林霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明出現(xiàn)嚴(yán)重錯(cuò)誤，其中氯林霉素、四環(huán)素嚴(yán)重錯(cuò)誤率均<3.0%，復(fù)方新諾明嚴(yán)重錯(cuò)誤率為3.1%。誘導(dǎo)性克林霉素出現(xiàn)極嚴(yán)重錯(cuò)誤，極嚴(yán)重錯(cuò)誤率為1.5%(表5)。

表4 快速法與傳統(tǒng)法鑒定革蘭陰性桿菌的準(zhǔn)確性分析[株(%)]Tab.4 Accuracy analysis of rapid method and traditional method in identification of Gram-negative bacilli [n(%)]

表5 革蘭陽(yáng)性球菌快速法與傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的符合率和錯(cuò)誤率分析[株(%)]Tab.5 Analysis of coincidence rate and error rate of rapid method and traditional method in drug sensitivity test of Grampositive cocci [n(%)]

2.5 革蘭陰性桿菌快速法與傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的符合率和錯(cuò)誤率分析 傳統(tǒng)法共分離出70株革蘭陰性桿菌，根據(jù)革蘭陰性桿菌藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果符合率統(tǒng)計(jì)，氨芐青霉素/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、米諾環(huán)素、替加環(huán)素、美羅培南、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的一般錯(cuò)誤率均≤10%，未出現(xiàn)嚴(yán)重錯(cuò)誤和極嚴(yán)重錯(cuò)誤，所有藥物均符合快速法和傳統(tǒng)法的藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)(表6)。

表6 革蘭陰性桿菌快速法與傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的符合率和錯(cuò)誤率分析[株(%)]Tab.6 Analysis of coincidence rate and error rate of rapid method and traditional method in drug sensitivity test of Gramnegative bacilli [n(%)]

3 討 論

血流感染引起的膿毒癥是住院患者尤其是重癥監(jiān)護(hù)室患者死亡的主要原因之一[6-7]。血培養(yǎng)是診斷血流感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，也是血流感染不可替代的確診試驗(yàn)方法。近年來(lái)，細(xì)菌的多重耐藥有上升趨勢(shì)[8-10]，且僅少數(shù)新開(kāi)發(fā)的抗生素被納入臨床治療中[11-12]。因此，血培養(yǎng)陽(yáng)性樣品的快速鑒定和藥敏試驗(yàn)尤為重要。

本研究結(jié)果顯示，快速法與傳統(tǒng)法鑒定的一致率為95.3%，鑒定革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陰性桿菌的一致率分別為94.9%和95.7%，均高于血清分離膠法MALDI-TOF MS直接鑒定，如馬堅(jiān)等[13]的研究中革蘭陽(yáng)性球菌和革蘭陰性桿菌的鑒定一致率分別為64.1%和35.9%，而李聰?shù)萚14]的研究中分別為52.9%和88.4%，Gu等[15]的研究中分別為71.0%和74.0%，分析其原因可能為快速法僅吸取10 μl樣本，可減少血培養(yǎng)液中血液細(xì)胞、纖維等成分的干擾。本研究發(fā)現(xiàn)，快速法與傳統(tǒng)法鑒定腸桿菌科具有很好的一致性，其中肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、黏質(zhì)沙雷菌、陰溝腸桿菌能夠全部被鑒定出，但1株銅綠假單胞菌和2株洋蔥伯克霍爾德菌等革蘭陰性桿菌未鑒定出，金黃色葡萄球菌、頭葡萄球菌、科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性球菌各1株未鑒定出。分析其原因可能是由于非發(fā)酵菌代謝較慢，獲取的菌液沉淀不足以達(dá)到MALDITOF MS分析的閾值，從而影響了鑒定結(jié)果，后期應(yīng)加大樣本量進(jìn)一步分析。

本研究采用MALDI-TOF MS鑒定病原菌，共分為2.300～3.000、2.000～2.299、1.700～1.999、<1.700 4個(gè)分值段，一般認(rèn)為分值≥2.000分為鑒定到種，1.700～1.999分為鑒定到屬，<1.700分為鑒定結(jié)果不可靠?？焖俜ㄨb定革蘭陽(yáng)性球菌≥1.700分72株，占91.1%(72/79)，鑒定革蘭陰性桿菌≥1.700分66株，占94.3%(66/70)，菌屬鑒定率達(dá)90.0%以上。傳統(tǒng)法與快速法鑒定的分值主要集中在2.000～2.299分，其中傳統(tǒng)法鑒定出的革蘭陽(yáng)性球菌占75.9%(60/79)，快速法鑒定出的革蘭陽(yáng)性球菌占56.0%(42/75)，且快速法鑒定分值在2.3 0 0 ～3.0 0 0 分占比達(dá)13.3%(10/75)。本研究還發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)法未見(jiàn)鑒定分值<1.700分的菌株，但快速法中革蘭陽(yáng)性球菌鑒定分值<1.700分占4.0%(3/75)，革蘭陰性球菌鑒定分值<1.700分占1.5%(1/67)。有學(xué)者建議在不影響準(zhǔn)確性的情況下，鑒定分值最低可降至1.4分[16-18]。因此，快速法可快速獲得細(xì)菌鑒定結(jié)果，直接為臨床醫(yī)師提供參考意見(jiàn)，必要時(shí)可針對(duì)目標(biāo)菌經(jīng)驗(yàn)用藥，盡早為患者提供有效治療。

目前，傳統(tǒng)法血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后，進(jìn)行細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)用時(shí)長(zhǎng)，通常需要48～72 h才可獲得準(zhǔn)確結(jié)果，難以滿足臨床及時(shí)獲取感染病原菌及其藥敏試驗(yàn)結(jié)果的需求。而快速法可縮短藥敏試驗(yàn)時(shí)間，且能提供準(zhǔn)確的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性桿菌藥敏試驗(yàn)中，美羅培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、替加環(huán)素、阿米卡星、氨芐西林/舒巴坦、米諾環(huán)素的藥敏結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)符合率≥90%、一般錯(cuò)誤率≤10%，未出現(xiàn)嚴(yán)重錯(cuò)誤和極嚴(yán)重錯(cuò)誤；革蘭陽(yáng)性球菌藥敏試驗(yàn)中，氯林霉素、四環(huán)素出現(xiàn)嚴(yán)重錯(cuò)誤，誘導(dǎo)性克林霉素出現(xiàn)極嚴(yán)重錯(cuò)誤，但均符合標(biāo)準(zhǔn)，值得注意的是復(fù)方新諾明藥敏結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重錯(cuò)誤，嚴(yán)重錯(cuò)誤率為3.1%，超出標(biāo)準(zhǔn)，后期應(yīng)加大樣本量進(jìn)一步分析原因。該結(jié)果與Barnini等[17]的研究一致：革蘭陰性桿菌和革蘭陽(yáng)性球菌在所有藥物檢測(cè)中的準(zhǔn)確性可達(dá)90%以上。本研究采用HB&L微生物培養(yǎng)儀聯(lián)合MALDI-TOF MS及VITEK 2 Compact儀器進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，可有效縮短菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)的時(shí)間，且能達(dá)到一定的準(zhǔn)確性。值得注意的是，本研究對(duì)于鑒定時(shí)間未進(jìn)行具體分析，且測(cè)試的菌株數(shù)量較少，后續(xù)仍需收集更多臨床標(biāo)本進(jìn)一步評(píng)估。

綜上所述，本研究采用HB&L微生物培養(yǎng)儀對(duì)快速培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本行直接鑒定和藥敏試驗(yàn)，突破傳統(tǒng)培養(yǎng)后應(yīng)用單個(gè)菌落進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)的局限，避免了血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本血液直接鑒定時(shí)血細(xì)胞引起的干擾，且可節(jié)省約24 h的培養(yǎng)時(shí)間，縮短了檢測(cè)周轉(zhuǎn)時(shí)間，具有一定的技術(shù)創(chuàng)新性，可為臨床血流感染的及時(shí)診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。該方法可幫助臨床醫(yī)師及時(shí)明確血流感染的病原菌，使醫(yī)師從經(jīng)驗(yàn)性使用廣譜抗菌藥物快速轉(zhuǎn)變?yōu)橛嗅槍?duì)性的靶向治療，降低了藥物毒性、耐藥性和醫(yī)療成本，從而提高臨床抗感染治療的效果。