高齡妊娠對子代大鼠海馬甲基化水平的影響

潘亞男，韓慰，楊靜，程莉，蔣莉*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014；2認(rèn)知發(fā)育與學(xué)習(xí)記憶障礙轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014；3重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所，重慶 400014

高齡妊娠指女性妊娠年齡≥35歲。隨著二胎政策的開放、女性受教育程度的提高，以及輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，女性生育年齡呈不斷推遲的趨勢。高齡父母的不良妊娠結(jié)局發(fā)生率不斷增高，其子代在遠(yuǎn)期患自閉癥、精神分裂癥、抑郁等神經(jīng)精神疾病的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增高[1-2]。我國一項(xiàng)大型CEPS數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，高齡母親生育的青少年在學(xué)習(xí)成績、認(rèn)知能力及健康狀況方面的表現(xiàn)均較差[3]。本課題組前期通過動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，高齡妊娠子代存在社會(huì)交往障礙、焦慮抑郁情緒及學(xué)習(xí)能力下降[4]；高齡妊娠子代海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖減少、遷移障礙，神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞分化異常，但具體機(jī)制尚不清楚[5]。DNA甲基化是目前研究最為深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及成熟過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究通過構(gòu)建高齡妊娠和適齡妊娠子代動(dòng)物模型，檢測并比較子代不同年齡段DNA甲基化的相關(guān)指標(biāo)，觀察高齡妊娠對子代海馬甲基化的影響，旨在進(jìn)一步探討高齡妊娠子代腦功能障礙的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 SPF級健康12月齡及3月齡雌性Sprague Dawley(SD)大鼠各10只、3月齡雄性SD大鼠10只由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號：SCXK(渝)2018-0003]，于SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝食、攝水，室內(nèi)溫度20～25 ℃，明暗周期12 h/12 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的倫理標(biāo)準(zhǔn)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt)1兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記的β-actin小鼠IgG抗體購自成都正能生物技術(shù)有限公司，Dnmt3A兔多克隆抗體、Dnmt3B兔多克隆抗體購自美國Genetex公司，5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)小鼠單克隆抗體購自英國Abcam公司，山羊抗小鼠IgG二抗(DyLight 549)購自亞科因武漢生物技術(shù)有限公司，DAPI購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，PCR引物購自中國生工生物工程(上海)股份有限公司，RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購自日本TaKaRa公司，ECL發(fā)光液購自美國Bio-Rad公司，DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，DNA甲基化定量檢測試劑盒購自美國Epigentek公司。

1.2 分組及標(biāo)本收集 高齡雌鼠(12月齡)與雄鼠(3月齡)交配產(chǎn)下的子代為高齡子代組(AMA組)，適齡雌鼠(3月齡)與雄鼠(3月齡)交配產(chǎn)下的子代為適齡子代組(對照組)。在生后第7、14、28天對兩組子代大鼠進(jìn)行處理，取大腦全腦與海馬組織。

1.3 Western blotting檢測海馬Dnmts蛋白表達(dá)水平 AMA組與對照組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各8只子鼠，取單側(cè)海馬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。麻醉后斷頭取腦，冰上分離海馬，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。用10%的分離膠、5%的濃縮膠電泳，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗(Dnmt1，1:1000；Dnmt3A，1:2000；Dnmt3B，1:1000；β-actin，1:1000)，4 ℃冰箱孵育過夜。TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗(1:5000)，室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，ECL發(fā)光顯影。采用Image Lab軟件分析灰度值，蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平以Dnmts/β-actin的比值表示。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測海馬Dnmts mRNA表達(dá)水平 AMA組與對照組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各8只子鼠，取單側(cè)海馬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照試劑盒說明書步驟提取子鼠海馬組織RNA，利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄體系將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Nanodrop分光光度計(jì)檢測cDNA濃度。反應(yīng)體系：正反向引物各0.2 μl，cDNA模板40 ng，SYBR Premix Ex Taq 5 μl，加蒸餾水至總體積10 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，最佳退火溫度退火30 s(Dnmt1 62.1 ℃，Dnmt3A 59.3 ℃，Dnmt3B 59.0 ℃)，擴(kuò)增39個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 免疫熒光檢測海馬5-mC的表達(dá) AMA組與對照組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各8只子鼠，取全腦進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。子鼠麻醉后予以0.9%氯化鈉溶液灌注，4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取全腦置于4%多聚甲醛中，于4 ℃冰箱中固定24 h。先后在15%和30%蔗糖溶液中脫水沉底，OCT冰凍切片包埋劑包埋，冠狀位切片(30 μm)保存于冰凍保護(hù)液中。貼片后置于枸櫞酸鹽修復(fù)液(pH=6.0)中95 ℃水浴加熱15 min，0.3%Triton-X-100浸泡15 min，10%BSA+0.3 mol/L甘氨酸溶液室溫封閉1 h。加入5-mC一抗(1:100) 4 ℃孵育24 h。室溫下復(fù)溫1 h。加入二抗(1:250)避光室溫孵育3 h，DAPI(1:2000)染核20 min，滴加抗熒光淬滅劑，封片。在90I熒光顯微鏡下觀察拍攝，并用NIS-Viewer軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.6 ELISA法檢測海馬5-mC的表達(dá) AMA組與對照組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)另取5只子鼠，取單側(cè)海馬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照DNA提取試劑盒說明書步驟提取子鼠海馬組織DNA，Nanodrop分光光度計(jì)測定DNA濃度。按照DNA甲基化定量檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測。在波長450 nm處檢測吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算5-mC含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組子代海馬Dnmts 蛋白的表達(dá)情況Western blotting檢測結(jié)果顯示，生后第7天，AMA組Dnmt3A蛋白表達(dá)明顯高于對照組(1.02±0.13vs. 0.85±0.13，P<0.05)；生后第14天，兩組間Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而生后第28天，AMA組Dnmt1、Dnmt3A蛋白表達(dá)明顯低于對照組(0.34±0.10vs.0.43±0.05；0.66±0.20vs. 0.91±0.22，P<0.05)(圖1)。

圖1 高齡妊娠對子代大鼠海馬Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Advanced pregnancy affects the expressions of Dnmt1, Dnmt3A and Dnmt3B protein in hippocampus of offspring rats

2.2 兩組子代海馬Dnmts mRNA的表達(dá)情況 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，生后第7、14天，兩組Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；生后第28天，AMA組Dnmt1 mRNA表達(dá)明顯低于對照組 (0.82±0.16vs.1.11±0.31，P<0.05)(圖2)。

圖2 高齡妊娠對子代大鼠海馬Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Advanced pregnancy affects the expressions of Dnmt1, Dnmt3A and Dnmt3B mRNA in hippocampus of offspring rats

2.3 免疫熒光檢測海馬5-mC的定位及表達(dá)情況海馬免疫熒光染色可見5-mC表達(dá)于大鼠海馬細(xì)胞核內(nèi)，在DG、CA1、CA3區(qū)均有表達(dá)。DG區(qū)細(xì)胞排列致密，CA3區(qū)細(xì)胞排列相對稀疏，DG區(qū)5-mC表達(dá)明顯強(qiáng)于CA3區(qū)。生后第7、14天，AMA組熒光強(qiáng)度高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(906.42±37.97vs. 839.36±59.60，951.92±41.53vs.906.93±37.88，P<0.05，圖3)。

圖3 高齡妊娠對子代大鼠海馬5-mC表達(dá)的影響Fig.3 Advanced pregnancy affects the expression of 5-mC in hippocampus of offspring rats

2.4 ELISA法檢測海馬5-mC的表達(dá)水平 ELISA檢測結(jié)果顯示，生后第7、14、28天，AMA組海馬5-mC的表達(dá)水平高于對照組，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 兩組子代大鼠海馬5-mC表達(dá)水平比較(%, ±s, n=5)Tab.2 Comparison of the 5-mC expression levels in hippocampus of offspring rats (%, ±s, n=5)

表2 兩組子代大鼠海馬5-mC表達(dá)水平比較(%, ±s, n=5)Tab.2 Comparison of the 5-mC expression levels in hippocampus of offspring rats (%, ±s, n=5)

組別 第7天 第14天 第28天對照組 1.34±0.32 1.34±0.13 1.42±0.24 AMA組 1.57±0.19 1.45±0.21 1.81±0.33 t 1.3580 0.9847 2.1570 P 0.2115 0.3536 0.0631

3 討 論

高齡妊娠所致子代神經(jīng)精神障礙及認(rèn)知發(fā)育問題越來越受到關(guān)注。眾所周知，海馬與個(gè)體學(xué)習(xí)、記憶、情緒調(diào)節(jié)等功能密切相關(guān)，且海馬部位神經(jīng)干細(xì)胞的成熟、遷移、分化是大腦結(jié)構(gòu)及功能的基礎(chǔ)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高齡妊娠可明顯抑制未成熟腦海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生，其機(jī)制尚不明確[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳修飾在神經(jīng)發(fā)生的不同階段均具有重要作用，DNA甲基化參與了多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機(jī)制[6]。為此，本研究通過構(gòu)建高齡妊娠和適齡妊娠子代動(dòng)物模型，對比觀察高齡妊娠是否影響子代海馬的甲基化水平，以探索海馬DNA甲基化是否與高齡妊娠子代神經(jīng)發(fā)生異常相關(guān)。

DNA甲基化主要指在CpG二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上增加一個(gè)甲基基團(tuán)形成5-mC。Dnmts家族是DNA甲基化形成的重要媒介，其中Dnmt1、Dnmt3具有催化作用，分別對復(fù)制過程中新合成的DNA子鏈以及完全未經(jīng)修飾的DNA雙鏈進(jìn)行甲基化修飾[7]。由于腦發(fā)育過程伴隨著Dnmts在大腦海馬的分布定位及表達(dá)水平改變[8]，因此，本實(shí)驗(yàn)檢測了AMA組與對照組子鼠生后第7、14、28天(腦發(fā)育水平相當(dāng)于人類新生兒期、嬰兒期及幼年期)海馬Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B蛋白及mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，生后第7天，AMA組海馬Dnmt3A蛋白表達(dá)較對照組明顯升高，生后第28天，AMA組海馬Dnmt1 mRNA及Dnmt1、Dnmt3A蛋白表達(dá)較對照組均明顯降低，提示高齡妊娠可影響子代海馬Dnmts的表達(dá)，高齡妊娠子代存在海馬DNA甲基化異常。有研究發(fā)現(xiàn)，Dnmts家族參與了神經(jīng)干細(xì)胞自我更新、細(xì)胞分化及成熟的過程[9]。Dnmt3A參與調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的定向分化，而Dnmt3B可促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞分化，抑制其增殖[8,10]；條件性敲除Dnmt1基因可導(dǎo)致神經(jīng)祖細(xì)胞提前向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高齡妊娠子代生后第7天，海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖標(biāo)志物Nestin蛋白及遷移標(biāo)志物Dcx蛋白表達(dá)水平明顯降低；生后第28天，海馬成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN表達(dá)水平升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP表達(dá)水平明顯降低，提示子代海馬神經(jīng)發(fā)生異常[5]，高齡妊娠可能通過干擾子代海馬Dnmts表達(dá)影響DNA甲基化修飾，進(jìn)而影響子代神經(jīng)發(fā)生。此外，Dnmts突變可導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)或功能損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，Dnmt3A基因敲除的胚胎在發(fā)育成熟后可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能異常、運(yùn)動(dòng)障礙；Dnmt1及Dnmt3A基因敲除小鼠的突觸可塑性受損[12]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Dnmt1基因突變可導(dǎo)致遺傳性感覺神經(jīng)病伴癡呆及聽力障礙[13]。

目前認(rèn)為，DNA甲基化在外界環(huán)境的影響下可發(fā)生動(dòng)態(tài)改變[14]。高齡雌鼠卵巢功能下降，子宮和胎盤功能減退[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，高齡雌鼠胚胎多個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平異常，著床前胚胎甲基化水平低于適齡雌鼠[17-18]。因此，母親高齡可能是影響子代甲基化水平的因素之一。本研究進(jìn)一步比較了AMA組與對照組海馬5-mC的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)生后第7、14天，AMA組海馬5-mC表達(dá)量較對照組明顯增加，提示AMA組海馬整體DNA甲基化水平升高。Western blotting檢測結(jié)果顯示，AMA組雖然生后第14、28天時(shí)Dnmts表達(dá)降低，但整體DNA甲基化水平仍高于對照組。這可能與DNA甲基化水平受多方面因素影響有關(guān)。DNA甲基化水平是甲基化形成和去甲基化動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果。Dnmts主要介導(dǎo)甲基化形成過程。近年來發(fā)現(xiàn)的去甲基化酶(TET酶)可介導(dǎo)5-mC逐步氧化還原，經(jīng)過胸苷嘧啶DNA糖基化酶(TDG)酶切除逆轉(zhuǎn)為未經(jīng)修飾的胞嘧啶[19-20]，從而降低甲基化水平。此外，DNA甲基化水平可能還受到DNA復(fù)制速率等因素的影響[21]。甲基化水平與疾病的關(guān)系較為復(fù)雜，目前尚不能明確高齡妊娠子代海馬的高甲基化狀態(tài)會(huì)對腦發(fā)育產(chǎn)生何種影響。結(jié)合DNA甲基化的作用主要是抑制基因表達(dá)，本課題組前期研究證實(shí)生后第14、28天，AMA組海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表達(dá)減少[4]。方金[22]的研究也發(fā)現(xiàn)，生后第7天高齡妊娠子代海馬區(qū)與神經(jīng)細(xì)胞增殖相關(guān)的Skp mRNA明顯低于適齡妊娠子代；高齡妊娠組成年子代海馬Edn1和Hspa1基因表達(dá)減少，前者具有類神經(jīng)遞質(zhì)功能，后者與海馬依賴的空間學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。在大腦發(fā)育的關(guān)鍵期，海馬高甲基化狀態(tài)可能通過抑制神經(jīng)營養(yǎng)因子、轉(zhuǎn)錄激活因子等蛋白的表達(dá)而干擾神經(jīng)發(fā)生，進(jìn)而影響海馬的結(jié)構(gòu)或功能，導(dǎo)致子代認(rèn)知發(fā)育障礙。

已有研究發(fā)現(xiàn)，多種神經(jīng)精神疾病存在DNA甲基化水平異常升高[23]。精神分裂癥患者的血液及邊緣性人格障礙患者的唾液中BDNF啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平升高[24]；抑郁患者BDNF、5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的啟動(dòng)子呈高甲基化狀態(tài)[25]；癲模型大鼠海馬的整體甲基化水平升高[26]。鑒于DNA甲基化具有可調(diào)控性，改善疾病的高甲基化狀態(tài)可以輔助疾病治療。研究發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥物治療后抑郁癥患者血液中BDNF啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平明顯下降[27]；以氮雜胞苷及地西他濱為代表的Dnmts抑制劑已被美國FDA批準(zhǔn)用作表觀遺傳修飾治療的一線藥物，應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療[28-29]。

綜上所述，本研究結(jié)果驗(yàn)證了高齡妊娠可引起子代海馬甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)異常，生后腦發(fā)育關(guān)鍵期DNA甲基化水平升高。探索高齡妊娠子代DNA甲基化異常有助于對高齡子代腦功能障礙發(fā)生機(jī)制的深入研究，并為針對性改善其子代腦功能障礙提供干預(yù)的方向。