恩替卡韋耐藥乙型肝炎病毒穩(wěn)定復(fù)制細胞系的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

張孝璐，楊蘭，孫巖松，徐東平，李曉峰，劉妍*，李浩*

1病原微生物生物安全國家重點實驗室，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，北京 100071；2解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部，北京 100039

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起急性及慢性乙型肝炎的重要病原體[1]。全世界約有2.91億人感染HBV，每年約有100萬人死于HBV引發(fā)的肝硬化或肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，占全球肝癌患者總數(shù)的50%以上[2]。為研究HBV的感染機制及生物學(xué)特性，近年來研究者們已建立了多種穩(wěn)定表達HBV病毒顆粒的細胞系，如HepG2.2.15細胞系[3]、HepAD38細胞系[4]、Huh7.93細胞系等[5]。經(jīng)典的HepG2.2.15細胞系已經(jīng)建立30余年，其宿主基因與原始HepG2細胞有很大差別，而這種差別可能是由于宿主基因組突變長時間累積導(dǎo)致的。2011年，Liu等[6]基于我國流行的C基因型恩替卡韋(entecavir，ETV)耐藥HBV病毒株，建立了HBV穩(wěn)定復(fù)制細胞系HepG2.A64(CCTCC C 201163)，維持在含380 μg/ml遺傳霉素(G418)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，可持續(xù)44個月以上產(chǎn)生乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)及HBV DNA。由于該細胞系可產(chǎn)生更多的病毒標志物及HBV cccDNA，且更易于培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，已成為研究耐藥HBV感染機制、生物學(xué)特性、藥物療效、治療方案、新藥及疫苗的又一個相對理想的模型。然而目前針對HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.A64細胞系轉(zhuǎn)錄組層面的研究尚少見。本研究利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對HepG2細胞與恩替卡韋耐藥乙型肝炎病毒(ETV-r HBV)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.A64細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行對比分析，探討HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對宿主細胞DNA修復(fù)相關(guān)基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器 人肝癌細胞系HepG2細胞(ATCC? HB-8065)購自美國ATCC公司；ETV-r HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.A64細胞系由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心自主研發(fā)構(gòu)建(CCTCC C 201163)，國家發(fā)明專利號ZL201010586554.6。EallBio胎牛血清購自北京中生奧邦生物科技有限公司；胰酶、青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺均購自美國Gibco公司；HBsAg酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；HBV核酸測定試劑盒(PCR-熒光探針法)購自中山大學(xué)達安基因股份有限公司；細胞RNA提取試劑盒(74136)購自德國QIAGEN公司；“一步法”實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(RR066A)購自日本TaKaRa公司；BCA蛋白測定試劑盒(A53226)購自美國賽默飛世爾科技公司；抗DNA損傷結(jié)合蛋白1(DDB1)抗體(ab133534)、抗X線修復(fù)交叉互補基因2(XRCC2)抗體(ab124900)、抗復(fù)制蛋白A1(RPA1)抗體(ab79398)、抗輻射敏感51(RAD51)抗體(ab133534)、抗輻射敏感52(R AD52)抗體(ab124971)、抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(ab6276)、山羊抗小鼠IgG抗體(ab205719)購自英國Abcam公司，山羊抗兔IgG抗體(GTX213110-01)購自美國GeneTex公司；熒光定量PCR儀(Mastercycler ep realplex)購自德國Eppendrof公司；Millipore發(fā)光底物HRP(ECL發(fā)光液，WBKLS0500)購自美國Millipore公司；蛋白電泳儀(PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀)購自美國Bio-Rad公司；Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)購自美國GE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2、HepG2.A64細胞均培養(yǎng)于含1%青霉素和鏈霉素、1% L-谷氨酰胺及10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合至90%時棄掉細胞上清，用2 ml PBS緩沖液洗滌2次后加1 ml胰酶消化，待顯微鏡下觀察到細胞變圓、不再連接成片時，加2 ml培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打培養(yǎng)瓶底部至所有細胞脫落，1000 r/min離心5 min，棄上清，加3 ml培養(yǎng)基重懸混勻細胞，取1 ml細胞懸液至培養(yǎng)瓶并補加4 ml培養(yǎng)基吹打混勻，置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 HBV標志物檢測 取對數(shù)生長期HepG2、HepG2.A64細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個/ml，將1 ml細胞傳代至25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，48 h后收集細胞培養(yǎng)基，10 000 r/min離心5 min，收集細胞培養(yǎng)基上清2 ml。隨后以相同細胞量進行細胞傳代，連續(xù)培養(yǎng)4代。取100 μl細胞上清液，采用ELISA法檢測HBsAg的含量，按照試劑盒說明書進行操作，ELISA法檢測設(shè)定：cut-off(CO)值=陰性對照樣本的OD值×2.1(OD值表示樣本在450 nm波長下的光密度值，陰性對照樣本的OD值低于0.05者按0.05計算)，樣品S/CO值≥1.0為陽性(S表示樣本的OD值，CO值表示檢測臨界值)；HBV DNA定量檢測按照HBV核酸測定試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書進行，根據(jù)標準品繪制的標準曲線計算樣品中HBV DNA的濃度。

1.2.3 RNA提取及測序 用Trizol法從HepG2細胞及HepG2.A64細胞中提取RNA(n=3)，用Agilent 2100生物分析儀檢測RNA完整性，通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，隨后在NEB片段化緩沖液(NEB Fragmentation Buffer)中將mRNA隨機打斷進行雙鏈cDNA合成。純化后的cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A、接頭，并用AMPure XP beads核酸純化試劑盒篩選250～300 bp的cDNA，經(jīng)PCR擴增及產(chǎn)物純化后獲得文庫。使用Qubit2.0熒光計對文庫進行初步定量，并稀釋至1.5 ng/μl，隨后使用Agilent 2100生物分析儀對文庫的插入片段大小(insert size)進行檢測，insert size符合預(yù)期后，借助Illumina測序平臺的Novaseq 6000進行RNA測序(RNA-seq)。

1.2.4 測序數(shù)據(jù)分析 采用Fastp(V0.19.4)軟件對測序獲得的原始數(shù)據(jù)進行過濾，使用Hisat2(2.0.5)軟件將得到的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)(clean reads)與人參考基因組(GRCH38)進行比對，并借助Subread軟件中的feature Counts(1.5.0-p3)工具統(tǒng)計每個基因的reads數(shù)，完成基因表達的定量分析。以GRCH38為參考基因組，|log2 Fold Change|>2、padj<0.05作為差異基因篩選條件，借助DESeq2(1.16.1)標準化方法統(tǒng)計差異基因并繪制差異基因火山圖；采用edgeR(3.18.1)軟件統(tǒng)計每個基因上的片段數(shù)作為基因的原始表達量，并用每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段(FPKM值)表示轉(zhuǎn)錄水平的基因表達值；clusterProfiler(3.4.4)軟件基于超幾何分布原理，對所有差異基因集注釋到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫的基因集并進行富集，其中padj<0.05的GO及KEGG詞條為顯著性富集項，padj<0.05的GO及KEGG通路為顯著性富集通路。

1.2.5 RT-qPCR檢測DNA修復(fù)相關(guān)基因mRNA的表達 利用primer design (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)網(wǎng)站針對DNA修復(fù)相關(guān)通路(同源重組修復(fù)通路、非同源末端連接、核酸切除修復(fù))中的代表性基因設(shè)計上、下游引物，序列見表1。利用QIAGEN公司的細胞RNA提取試劑盒提取HepG2、HepG2.A64細胞的RNA，將細胞RNA稀釋至同一濃度(50 ng/μl)，采用“一步法”RT-qPCR試劑盒檢測HepG2、HepG2.A64細胞中DNA修復(fù)相關(guān)基因的相對表達量，以β-actin作為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計算檢測結(jié)果，用GraPhad Prism6軟件作圖。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primers sequence for RT-qPCR

1.2.6 Western blotting檢測DNA修復(fù)相關(guān)基因蛋白表達水平 利用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解HepG2和HepG2.A64細胞，使用BCA蛋白測定試劑盒對裂解得到的細胞蛋白進行定量，隨后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并在100 mA恒定電流下將蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇激活過的PVDF膜上(35 min)。利用5%脫脂奶粉稀釋一抗，各抗體稀釋比例分別為DDB1(1:10 000)、XRCC2(1:10 000)、RPA1(1:1000)、RAD51(1:1000)、RAD52(1:500)、β-actin(1:5000)，一抗與PVDF膜4 ℃孵育過夜。取出PVDF膜，用TBST洗滌一抗，8 min/次，共4次；用5%脫脂奶粉稀釋HRP標記的山羊抗兔IgG抗體(1:5000)及山羊抗小鼠IgG抗體(1:5000)，室溫下與PVDF膜孵育1 h，取出PVDF膜，用TBST洗滌一抗，8 min/次，共4次；用Millipore發(fā)光底物HRP(ECL發(fā)光液)洗膜，然后在Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)中顯影。利用Image J軟件對顯影條帶進行灰度值統(tǒng)計，將目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表目的基因蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，兩細胞系差異基因的比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系鑒定 ELISA檢測及HBV DNA熒光探針法定量檢測結(jié)果顯示，HepG2.A64細胞系中的HBV能夠持續(xù)高水平復(fù)制并在細胞上清中穩(wěn)定表達HBsAg、HBV DNA。在連續(xù)4代的培養(yǎng)過程中，HepG2.A64細胞上清中HBsAg含量的S/CO值維持在5.89±0.86，HBV DNA的含量維持在(12212.75±112.57) IU/ml，而HepG2細胞系的細胞培養(yǎng)上清中未檢出HBV標志物(圖1)。

圖1 HepG2、HepG2.A64細胞的乙肝標志物檢測Fig.1 Detection of hepatitis B markers in HepG2 and HepG2.A64 cells

2.2 HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后宿主細胞轉(zhuǎn)錄組的基因表達變化 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，與HepG2細胞系相比，ETV-r HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.A64細胞系共有613個基因存在差異表達，其中401個上調(diào)，212個下調(diào)；有26 447個基因表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2A)。對差異基因進行聚類分析，結(jié)果顯示，ETV-r HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.A64細胞系表達下調(diào)的基因主要集中在MAPK信號通路、DNA復(fù)制、細胞周期相關(guān)通路中，表達上調(diào)的基因主要集中在肝細胞癌、P53信號通路、Wnt信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解等相關(guān)通路中(圖2B)。

圖2 差異表達基因的火山圖及聚類熱圖Fig.2 Volcano map and cluster heat map of differentially expressed genes

2.3 HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后宿主細胞差異表達基因的分析及功能富集 利用GO功能富集及KEGG通路富集對差異表達基因進行富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，表達水平變化具有顯著差異的前5個基因Terms主要與炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體活性調(diào)節(jié)、代謝等生物學(xué)功能相關(guān)。將這些通路所涉及的基因按照padj值從小到大排列，選擇差異表達最顯著的前12個基因(圖3A、表2)。其中，與HepG2細胞系相比，ET V-r HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.A64細胞系中腸堿性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase，ALPI)、胎盤堿性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，ALPP)、微纖維相關(guān)蛋白5(microfibril associated protein 5，MFAP5)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4(insulin-like growth factor binding protein 4，IGFBP4)、絲氨酸蛋白酶抑制劑B5(serine protease inhibitor B5，SERPINB5)、Ⅳ型膠原α2鏈(collagen type Ⅳ alpha 2 chain，COL4A2)、ⅩⅤ型膠原α1鏈(collagen type ⅩⅤ alpha 1 chai，COL15A1)等基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達量明顯降低，嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A，CGA)、α2-巨球蛋白基因(α2-macroglobulin，A2M)、黑色素瘤抗原基因A3(melanoma-associated antigens A3，MAGEA3)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族成員5(glypican 5，GPC5)等基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。KEGG富集分析結(jié)果顯示，HBV感染后宿主細胞差異表達基因顯著富集在PI3K/Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染、細胞黏附分子、PPAR信號通路、NF-κB信號通路以及免疫相關(guān)通路中(圖3B)，提示HBV感染可能影響了細胞分化、發(fā)育、代謝(糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì))，以及高等生物的腫瘤發(fā)生等過程。

圖3 差異表達基因富集分析Fig.3 Enrichment analysis of differentially expressed genes

表2 HepG2.A64細胞與HepG2細胞差異表達基因的特征Tab.2 Characteristics of differentially expressed genes in HepG2.A64 cells compared to HepG2 cells

2.4 H BV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后宿主細胞DNA修復(fù)相關(guān)基因表達的變化 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與HepG2細胞相比，HepG2.A64細胞中RAD51 mRNA表達量下降62.25%±5.03%，RAD52 mRNA表達量下降68.96%±7.59%，XRCC2 mRNA表達量下降69.58%±6.32%，DDB1 mRNA表達量下降64.0%±9.41%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4A)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與HepG2細胞相比，HepG2.A64細胞中RAD52、XRCC2蛋白表達下調(diào)，其中RAD52蛋白表達量下降69.93%±3.88%，XRCC2蛋白表達量下降26.47%±12.7%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4B、4C)。

圖4 兩細胞系DNA修復(fù)通路中相關(guān)基因的RT-qPCR和Western blotting檢測結(jié)果Fig.4 RT-qPCR and Western blotting analysis of related genes of HepG2.A64 and HepG2 cells in DNA repair pathway

3 討 論

HepG2.A64細胞系作為基于ETV耐藥HBV病毒株建立的穩(wěn)定表達HBV的細胞模型，目前已被用于抗病毒機制、病毒感染與耐藥機制等方面的研究。例如，Liu等[6]利用HepG2.A64細胞系探究多藥耐藥蛋白4(multidrug resistance protein 4，MRP4)在核苷類似物抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療中的作用機制，證實聯(lián)合應(yīng)用核苷類似物和多藥耐藥蛋白抑制劑可減少核苷類似物的長期使用劑量；Liu等[7]利用HepG2.A64細胞系探究MPR4在拉米夫定和ETV轉(zhuǎn)運過程中的作用；Liu等[8]利用HepG2.A64評價中藥提取物肅毒星的抗HBV效應(yīng)；本課題組前期利用HepG2.A64細胞系評估成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)對HBV的清除作用[9]，并發(fā)現(xiàn)CRISPR清除HBV后HepG2.A64細胞中發(fā)生了大量染色體突變恢復(fù)的現(xiàn)象[10]。

本研究利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與HepG2細胞系相比，ETV-r HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HepG2.A64細胞系中共有613個基因存在差異表達，且差異表達基因主要存在于炎癥反應(yīng)、PPAR信號通路、NF-κB信號通路、免疫相關(guān)通路中。其中，ALPP、MFAP5、SERPINB5、ALPI、IGFBP4、COL4A2、COL15A1等基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達量顯著降低。而此前研究人員已在卵巢腺癌、漿液性囊腺癌和其他卵巢癌細胞中檢測到ALPP基因的強異位表達，另外利用基因芯片技術(shù)篩選的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌細胞中ALPP基因表達水平也明顯下降[11]。MFAP5是細胞外彈性微纖維的組成部分，主要在組織發(fā)育過程中起作用[12-13]，并具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用[14]。SERPINB5基因作為胰腺癌的生物標志物[15]，可阻止腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。本研究結(jié)果為今后HBV感染及肝癌發(fā)生中相關(guān)基因的作用機制研究提供了參考。

結(jié)合以往有關(guān)HBV感染與宿主細胞DNA修復(fù)的研究[17-20]，筆者推測本研究中ETV-r HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.A64細胞系在轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)大量差異表達基因可能與HBV感染抑制了宿主細胞的DNA修復(fù)能力有關(guān)。Sekiba等[21]研究證實，HBx蛋白能夠與DDB1亞基相互作用，從而干擾DNA的修復(fù)能力，也可通過E3泛素連接酶靶向降解用于維持染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的Smc5/6復(fù)合體，解除Smc5/6復(fù)合體對HBV基因組轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的抑制作用[17-19,22-23]。同時，HBx蛋白在細胞質(zhì)中可通過劫持p53基因而與細胞核中的DNA修復(fù)相關(guān)基因(如DDB1、XPB、XPD和TFIIH)發(fā)生相互作用[24]，其中HBx與TFIIH組分XPB和XPD的相互作用可使UV誘導(dǎo)DNA損傷的宿主修復(fù)能力產(chǎn)生缺陷[25-28]。本研究結(jié)果顯示，與HepG2細胞系比較，ETV-r HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HepG2.A64細胞系中RAD52和XRCC2基因mRNA和蛋白表達水平均顯著降低。RAD52基因?qū)S持腫瘤基因組的完整性至關(guān)重要，可在同源重組通路中驅(qū)動雙鏈斷裂修復(fù)時以RNA為模板的DNA反向鏈交換[29-30]，且RAD52中的SNPs與乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、頭頸癌和卵巢癌等多種癌癥的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)[31]。此外，Sotiriou等[32]研究發(fā)現(xiàn)，RAD52與癌基因誘導(dǎo)的DNA復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。XRCC2基因同樣為同源重組通路中的關(guān)鍵基因，參與將RAD51募集至DNA損傷部位，可以結(jié)合DNA并促進其同源配對[33]；有研究表明XRCC2突變的細胞具有更高的自發(fā)染色體不穩(wěn)定水平，且對DNA鏈間交聯(lián)劑(如絲裂霉素C和順鉑)、電離輻射以及烷基化劑和醛類表現(xiàn)出超敏性[34]，同時該基因的有害雜合突變會增加患乳腺癌的風(fēng)險[35]。

綜上所述，ETV-r HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后宿主細胞中出現(xiàn)大量差異表達基因，且宿主細胞同源重組修復(fù)中的關(guān)鍵基因RAD52及XRCC2表達量下調(diào)，提示HBV感染宿主細胞后可能通過劫持RAD52和XRCC2基因抑制宿主細胞的DNA修復(fù)能力，使受損DNA因不能得到及時有效的修復(fù)而不斷累積，進而導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定、病毒基因組整合以及腫瘤發(fā)生。然而有關(guān)HBV感染抑制DNA損傷修復(fù)中關(guān)鍵基因的具體作用機制仍有待進一步研究。