郭中州,張亞南,劉季晨,郭志剛
南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣州 510515
動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性炎癥性疾病[1],降脂聯(lián)合抗炎治療可降低其主要心血管事件的發(fā)生率[2-3]。研究證實(shí),巨噬細(xì)胞在AS的炎癥反應(yīng)過程中扮演了重要角色[4]。本課題組前期研究結(jié)果顯示,過表達(dá)脯氨酸/絲氨酸豐富的卷曲螺旋蛋白1(proline/serine-rich coiled-coil protein 1,PSRC1)可通過抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)延緩AS的進(jìn)展[5]。PSRC1是由PSRC1基因編碼的一種微管結(jié)合蛋白,其中一端可與發(fā)揮細(xì)胞支撐作用的微管蛋白結(jié)合以維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性,但僅存在于胞質(zhì)內(nèi),且其影響巨噬細(xì)胞炎性因子釋放的確切分子機(jī)制國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。因此,本課題組提出PSRC1的另一端與細(xì)胞內(nèi)某種其他蛋白結(jié)合而抑制炎癥反應(yīng),進(jìn)而發(fā)揮抑制AS作用的假設(shè),以尋找影響巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的新靶點(diǎn),為防治AS提供新的思路。
1.1 主要材料 小鼠巨噬細(xì)胞R AW264.7購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。重組腺病毒載體Ad-PSRC1、Ad-GFP及Ad-shANXA2由和元生物技術(shù)(上海)有限公司構(gòu)建;ox-LDL購(gòu)自廣州奕源生物科技有限公司,ANXA2單克隆抗體購(gòu)自研如玉(廣州)生物科技有限公司,DAPI染色液購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司,RNA提取試劑Trizol及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司,RT-PCR引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司,DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,PBS購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;離心管、EP管購(gòu)自美國(guó)Axygen公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)Corning公司;牛血清白蛋白(BSA)、油紅O染料購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司;ANXA2 ELISA試劑盒購(gòu)自廣州徠智生物科技有限公司,白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自廣州佳研生物科技有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定與PSRC1結(jié)合上調(diào)的蛋白 將RAW264.7巨噬細(xì)胞分為Ad-GFP+ox-LDL組(Ad-GFP+100 μg/ml ox-LDL)與Ad-PSRC1+ox-LDL組(Ad-PSRC1+100 μg/ml ox-LDL)。ox-LDL刺激24 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解,使用抗-FLAG?M2磁珠(Millipore,Cat. M8823)對(duì)兩組細(xì)胞裂解液進(jìn)行下拉試驗(yàn),所獲產(chǎn)物在南方醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室使用超高分辨三合一質(zhì)譜儀(Thermo ScientificTMOrbitrap FusionTMTribridTM)進(jìn)行數(shù)據(jù)非依賴(data independent acquisition,DIA)的定量質(zhì)譜分析,具體步驟如下。首先對(duì)樣品進(jìn)行還原烷基化、胰酶酶解;然后對(duì)酶解后肽段除去非揮發(fā)性鹽,分別進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴(data dependent acquisition,DDA)圖譜采集及數(shù)據(jù)非依賴采集(data independent acquisition,DIA);最后,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Skyline軟件(Skyline v4.2 Released on 11/01/2018)進(jìn)行定量分析。將Ad-PSRC1+ox-LDL組/Ad-GFP+ox-LDL組變化倍數(shù)上調(diào)1.2倍以上,且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,F(xiàn)DR)<0.05的蛋白質(zhì)作為與PSRC1結(jié)合上調(diào)的蛋白質(zhì)。
1.2.2 免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白質(zhì)譜結(jié)果 過表達(dá)Co-IP:構(gòu)建帶有標(biāo)簽蛋白的PSRC1真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1/flag-PSRC1)并轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞中,以ox-LDL刺激24 h。裂解細(xì)胞,提取胞質(zhì)中的蛋白。采用ANTI-FLAG M2 Magnetic beads(Sigma)進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn),再用標(biāo)簽蛋白或相應(yīng)蛋白抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè),比較刺激前后ANXA2與PSRC1相互作用的變化。內(nèi)源Co-IP:使用ANXA2抗體對(duì)ox-LDL刺激24 h前后的RAW264.7細(xì)胞裂解液進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn),再采用PSRC1抗體或ANXA2抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。
1.2.3 ELISA檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞過表達(dá)PSRC1后在ox-LDL刺激下的ANXA2分泌情況 實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組(正常培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清)、ox-LDL組(用100 μg/ml ox-LDL刺激24 h)、Ad-GFP+ox-LDL組(外源過表達(dá)GFP后加100 μg/ml ox-LDL刺激24 h)、Ad-PSRC1+ox-LDL組(外源過表達(dá)PSRC1后加100 μg/ml ox-LDL刺激24 h)。RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中,并置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后,根據(jù)分組情況用同體積的Ad-GFP或Ad-PSRC1轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)細(xì)胞48 h。實(shí)驗(yàn)前,各組細(xì)胞饑餓24 h處理,用100 μg/ml的ox-LDL干預(yù)細(xì)胞48 h后使其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,采用ELISA法檢測(cè)各組上清中ANXA2的水平。
1.2.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PSRC1、ANXA2的細(xì)胞內(nèi)共定位情況 胰酶消化RAW264.7細(xì)胞使其脫落,稀釋至細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,將細(xì)胞定植于共聚焦皿中。將4%多聚甲醛20 μl滴至細(xì)胞表面,靜置30 min,PBS洗3次;用5% BSA 100 μl對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉1 h,PBS洗2或3次;用5% BSA稀釋一抗,加入ANXA2抗體(兔抗),濃度為1:100(即1 μl),同時(shí),加入PSRC1抗體(鼠抗),濃度為1:100(即1 μl),避光,4 ℃共同孵育抗體12 h。棄去抗體,PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次。用PBS稀釋AF488羊抗鼠熒光二抗(1:100)和AF551羊抗兔熒光二抗(1:100),室溫下以100 μl稀釋好的二抗孵育細(xì)胞1 h,避光。棄去二抗,PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次。加入5% Triton破膜15 min,染DAPI 15 min后,甘油明膠封片,采用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。
1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ANXA2 mRNA的表達(dá)情況 將RAW264.7巨噬細(xì)胞分為Ad-GFP組與AdshANXA2組。收集細(xì)胞并離心后,棄去舊培養(yǎng)基,加入無菌PBS洗滌,1000 r/min 離心5 min分離細(xì)胞,加入Trizol試劑后在4 ℃條件下充分裂解5 min。將獲得的裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中,加入氯仿200 μl充分震蕩,在4 ℃每件下靜置5 min,然后4 ℃、12 000 r/min離心15 min,吸出上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)1.5 ml EP管內(nèi)。取500 μl異丙醇加入EP管,充分震蕩后低溫靜置5 min,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,棄上清,保留RNA沉淀物。將1 ml 75%乙醇加入RNA沉淀中,低溫靜置5 min,然后4 ℃、7500 r/min離心10 min,棄上清,保留最后的RNA沉淀。待RNA沉淀干燥后,EP管內(nèi)加入20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)進(jìn)行溶解。將所得RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,按照TaKaRa SYBR Green PCR Master Mix Kit試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
1.2.6 油紅O染色檢測(cè)主動(dòng)脈大體及主動(dòng)脈根部斑塊情況 構(gòu)建ANXA2敲低的ApoE-/-小鼠模型:將24只8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為四組(n=6):普通飲食+Ad-GFP組、普通飲食+Ad-shANXA2組、高脂飲食+Ad-GFP組、高脂飲食+Ad-shANXA2組,分別給予普通飼料或高脂飼料喂養(yǎng)。8周后分別經(jīng)尾靜脈注射Ad-GFP或Ad-shANXA2,注射劑量為5×108pfu。繼續(xù)普通飲食或高脂飲食喂養(yǎng)2周,再次分別經(jīng)尾靜脈注射Ad-GFP或Ad-shANXA2,繼續(xù)普通飲食或高脂飲食喂養(yǎng)2周。分離各組小鼠的主動(dòng)脈大體標(biāo)本,并取主動(dòng)脈根部行冷凍切片,對(duì)大體及切片行油紅O染色。心尖取血,3000 r/min離心10 min,取上清,分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.7 ELISA法檢測(cè)血清中IL-1β及IL-6蛋白表達(dá)水平 由于普通飲食兩組小鼠斑塊差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而高脂飲食兩組小鼠的斑塊面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此采用ELISA法進(jìn)一步對(duì)1.2.6中收集的高脂飲食+Ad-GFP組與高脂飲食+Ad-shANXA2組小鼠血清中的IL-1β、IL-6表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism Version 8.3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性檢測(cè),均為正態(tài)分布,以表示,兩組間比較采用Student-t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 ox-LDL刺激對(duì)PSRC1與ANXA2結(jié)合的影響通過非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定與PSRC1結(jié)合上調(diào)的蛋白(表1),結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAW264.7巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒過表達(dá)PSRC1后,在ox-LDL刺激下,與GFP對(duì)照組比較,Ad-PSRC1組免疫共沉淀的質(zhì)譜總離子流明顯改變,STRING軟件分析發(fā)現(xiàn)PSRC1與ANXA2結(jié)合明顯升高,增加了8.91倍(圖1)。對(duì)上述質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行Co-IP驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)譜結(jié)果一致,在ox-LDL刺激下,PSRC1與ANXA2的結(jié)合明顯增加,且其結(jié)合具有特異性(圖2)。
表1 與PSRC1結(jié)合上調(diào)的蛋白基本信息Tab.1 Basic information of upregulated proteins binding to PSRC1
2.2 RAW264.7巨噬細(xì)胞過表達(dá)PSRC1對(duì)ANXA2細(xì)胞外分泌的影響 E LI S A 檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,ox-LDL組ANXA2的水平明顯升高[(2027.23±93.55) pg/mlvs. (697.01±30.08) pg/ml,P<0.01,圖3A];與Ad-GFP+ox-LDL組比較,Ad-PSRC1+ox-LDL組A NX A2的水平明顯降低[(1061.65±68.52) pg/mlvs. (2098.67±318.41) pg/ml,P<0.01,圖3B)。
2.3 PSRC1與ANXA2的細(xì)胞內(nèi)共定位情況 免疫熒光染色后對(duì)細(xì)胞切片進(jìn)行共聚焦觀察發(fā)現(xiàn),ANXA2與PSRC1在細(xì)胞內(nèi)存在明顯的共定位現(xiàn)象(圖4)。
2.4 腺病毒Ad-shANXA2對(duì)ANXA2的敲低效果RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與Ad-GFP組比較,AdshANXA2組ANXA2 mRNA的表達(dá)水平明顯降低(0.198±0.065vs. 1.002±0.069,P<0.05)。
2.5 ANXA2敲低后對(duì)主動(dòng)脈大體及主動(dòng)脈根部斑塊面積的影響 油紅O染色結(jié)果顯示,普通飲食與高脂飲食喂養(yǎng)小鼠主動(dòng)脈產(chǎn)生部分AS斑塊,普通飲食+Ad-shANXA2組與普通飲食+Ad-GFP組的斑塊面積百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.08%±0.16%vs.2.01%±0.10%,P>0.05,圖5A),而與高脂飲食+Ad-GFP組比較,高脂飲食+Ad-shANXA2組斑塊面積百分比明顯減少(5.29%±1.14%vs. 12.28%±2.48%,P<0.05,圖5B)。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),普通飲食+AdshANXA2組主動(dòng)脈根部斑塊面積百分比與普通飲食+Ad-GFP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.80%±0.02%vs. 0.79%±0.02%,P>0.05,圖6A),而高脂飲食+Ad-shANXA2組主動(dòng)脈根部斑塊面積百分比與高脂飲食+Ad-GFP組比較明顯降低(1.31%±0.04%vs.2.83%±0.22%,P<0.05,圖6B)。
2.6 ANXA2敲低對(duì)APOE-/-小鼠血清炎性因子IL-1β、IL-6釋放的影響 由于普通飲食兩組小鼠斑塊差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而高脂飲食兩組小鼠的斑塊面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此進(jìn)一步在高脂飲食兩組小鼠中進(jìn)行炎性因子檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與高脂飲食+Ad-GFP組比較,高脂飲食+Ad-shANXA2組小鼠血清IL-1β[(122.90±9.80) pg/mlvs. (172.90±21.83) pg/ml]及IL-6水平[(3.65±0.12) pg/mlvs. (5.97±0.42) pg/ml]均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
AS與血脂代謝紊亂及免疫炎癥息息相關(guān)[6-7]。自從21世紀(jì)人類基因圖譜公布以后,Samani等[8]發(fā)表了全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wild Association Studies,GWAS),證實(shí)PSRC1基因表達(dá)水平與冠心病的發(fā)生有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),PSRC1基因表達(dá)水平升高可引起HDL-C水平升高、LDL-C水平降低,從而使患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)降低[9]。除影響血脂水平外,PSRC1基因還可調(diào)節(jié)人體對(duì)他汀類藥物治療的反應(yīng)性[10]。以上研究結(jié)果表明,PSRC1與脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān),并可通過調(diào)節(jié)血脂來影響AS的發(fā)生發(fā)展過程。PSRC1不僅可影響血脂,還可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)[9]。本課題組前期研究結(jié)果提示,PSRC1的表達(dá)可能與AS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5],但具體作用及機(jī)制并不完全明了。因此,本課題組前期通過腺病毒轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞觀察了PSRC1過表達(dá)對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響,并通過尾靜脈注射腺病毒,使ApoE-/-小鼠全身過表達(dá)PSRC1基因,觀察其對(duì)AS發(fā)生發(fā)展的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PSRC1可通過抑制APOE-/-小鼠的炎癥反應(yīng)及影響血脂代謝而抑制A S的進(jìn)展,但其確切的分子機(jī)制尚不明確。為了尋找能與PSRC1結(jié)合的蛋白,本研究進(jìn)行了非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)在RAW264.7巨噬細(xì)胞過表達(dá)PSRC1后,再用ox-LDL刺激,PSRC1與一種名為ANXA2的蛋白結(jié)合最多,且與蛋白質(zhì)譜Co-IP及免疫熒光檢測(cè)的結(jié)果一致。
圖1 非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定與PSRC1相互作用的蛋白Fig.1 Label free quantitative proteomics identification of proteins interacting with PSRC1
圖2 免疫共沉淀驗(yàn)證PSRC1與ANXA2的結(jié)合Fig.2 Co-immunoprecipitation to verify the binding of PSRC1 and ANXA2
圖3 RAW264.7巨噬細(xì)胞過表達(dá)PSRC1對(duì)培養(yǎng)上清中ANXA2水平的影響Fig.3 ANXA2 in RAW264.7 supernatant after over-expression of PSRC1 (ELISA)
圖5 普通飲食或高脂飲食喂養(yǎng)+病毒轉(zhuǎn)染apoE-/-小鼠主動(dòng)脈大體標(biāo)本油紅O染色Fig.5 Aortas of apoE-/- mice under standard rodent chow or high-fat diet transfected with adenovirus (Oil red O staining)
圖6 普通飲食或高脂飲食喂養(yǎng)+病毒轉(zhuǎn)染apoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅O染色(×400)Fig.6 Aortic root tissue of apoE-/- mice under standard rodent chow or an high-fat diet transfected with adenovirus (Oil red O staining,×400)
ANXA2是膜聯(lián)蛋白家族(Annexins)的成員之一,其主要特點(diǎn)為能夠與鈣離子結(jié)合,從而參與一系列依賴于鈣離子的生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程。ANXA2廣泛存在于身體各個(gè)部位,但不同組織與細(xì)胞中的ANXA2含量相差甚遠(yuǎn)。在組織水平上,ANAX2在肺、胰腺、腎上腺等組織中高表達(dá),在肝臟及腎臟組織中低表達(dá);在細(xì)胞水平上,ANAX2在單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中高表達(dá)[11]。此外,ANXA2廣泛存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外,既能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮胞膜相關(guān)的生理功能,又能釋放至胞外發(fā)揮作用。研究表明,細(xì)胞膜上的ANXA2可作為受體與纖溶酶原結(jié)合,并使其與組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator,tPA)結(jié)合,促進(jìn)纖溶酶的形成[12-13]。此外,ANXA2還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移及新生血管的形成[12]。而在AS的發(fā)生發(fā)展中,ANXA2所扮演的角色尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn),在肝臟細(xì)胞胞膜上,ANXA2可與前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)結(jié)合,抑制PCSK9對(duì)低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)的降解[14-15]。然而,也有研究發(fā)現(xiàn),ANXA2可介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶9(metalloproteinase-9,MMP-9)的釋放,他汀類藥物則能夠通過抑制ANXA2的表達(dá)減少M(fèi)MP-9的釋放,穩(wěn)定粥樣硬化斑塊[16]。此外,Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn),ANXA2可介導(dǎo)AS斑塊處巨噬細(xì)胞的遷移,并增加炎性因子的釋放,促進(jìn)炎癥反應(yīng)。Swisher等[18-19]發(fā)現(xiàn),胞外的ANXA2可與巨噬細(xì)胞表面的TLR4受體結(jié)合,促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6及TNF-α。因此,我們推測(cè)PSRC1過表達(dá)可抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng),可能是因?yàn)锳NXA2與PSRC1的結(jié)合增加,從而改變了下游炎癥信號(hào)通路所致。
為明確PSRC1對(duì)ANXA2的影響,本研究在細(xì)胞水平進(jìn)行了探討,以ox-LDL刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞后,采用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中ANXA2含量,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞釋放的ANXA2增加,而過表達(dá)PSRC1后再用ox-LDL刺激,與Ad-GFP組比較,巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中的ANXA2明顯減少,提示PSRC1對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的ANXA2釋放起負(fù)調(diào)控作用。隨后本研究在動(dòng)物水平進(jìn)行了分析,構(gòu)建了小鼠AS模型并用腺病毒尾靜脈注射以敲低小鼠體內(nèi)的ANXA2水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制ANXA2的表達(dá)可明顯減少斑塊面積,且可降低血清中炎性因子IL-1β、IL-6的水平。
綜上所述,本研究結(jié)果證實(shí)PSRC1可通過與ANXA2結(jié)合而抑制ANXA2的細(xì)胞外釋放,進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng),并最終延緩AS的進(jìn)展,為AS的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù),也為AS的抗炎治療提供了新靶點(diǎn)。后續(xù)可通過構(gòu)建PSRC1-/-ANXA2-/-雙敲除小鼠模型來進(jìn)行PSRC1敲除情況下的驗(yàn)證。