載IR-820相變型納米粒雙模態(tài)成像及其對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞光動(dòng)力效應(yīng)的體外研究

梁竹西，何欣雨，常淑芳，王志剛，郝蘭，李發(fā)琪，朱深銀*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400016；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400010；3超聲分子影像學(xué)重慶市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400010

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)[1-2]是一種自身免疫反應(yīng)所致的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)滑膜炎性病變，常累及關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)軟骨及周?chē)浗M織，病程反復(fù)，致殘率高，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，早診斷、早治療是其治療的關(guān)鍵[3-4]。RA病程進(jìn)展的主要原因?yàn)殛P(guān)節(jié)滑膜組織成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs)[5]及巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞具有類(lèi)似腫瘤細(xì)胞的高增殖、侵襲、遷移及抗凋亡特征，如能早期監(jiān)測(cè)FLSs的異常增殖并進(jìn)行干預(yù)，對(duì)緩解RA病程具有重要意義。

近年來(lái)，基于某種光敏劑(如卟啉及卟啉衍生物等)在特定波長(zhǎng)的激光輻照后產(chǎn)生具有殺傷作用的單線態(tài)氧和活性氧(reactive oxygen species，ROS)[6]的光動(dòng)力治療(photodynamic therapy，PDT)[7-8]已廣泛應(yīng)用于體表腫瘤的治療。通過(guò)PDT治療具有類(lèi)似于腫瘤組織病理特性的RA滑膜炎病變，有望緩解RA的病程進(jìn)展。目前，RA關(guān)節(jié)病變的影像學(xué)診斷方式主要以單一成像模式(X線、CT、MRI、超聲)為主，存在各種弊端，可導(dǎo)致早期病變的診斷準(zhǔn)確性不高。因此，探索多模態(tài)超聲分子成像[9]對(duì)RA滑膜炎早期病變的診斷價(jià)值具有重要臨床意義。本研究擬采用雙乳化法制備包載IR-820[10]和全氟正戊烷(perfluoropentane，PFP)[11]的聚乳酸羥基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)納米粒(IR-820/PFP@PLGA)，一方面基于IR-820的光熱轉(zhuǎn)換性能促使PFP相變，賦予該納米粒增強(qiáng)超聲成像的能力，實(shí)現(xiàn)RA滑膜病變的超聲成像及光聲成像診斷；另一方面基于IR-820的光動(dòng)力作用，使IR-820/PFP@PLGA納米粒能對(duì)RA滑膜病變中增殖及炎癥激活的FLSs細(xì)胞進(jìn)行光動(dòng)力治療，以探索RA滑膜病變?cè)\療一體化的可能。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備 羧基端乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH，分子量12 kD，聚合比50:50)購(gòu)自濟(jì)南岱罡生物工程有限公司，異丙醇、IR-820購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldr ich公司，全氟正戊烷(perfluoropentane，PFP)購(gòu)自北京百靈威科技有限公司，胰酶細(xì)胞消化液、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二氯甲烷購(gòu)自重慶川東化工公司，瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司，酶標(biāo)儀、單線態(tài)氧熒光(SOSG)探針、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，RA FLSs MH7A細(xì)胞株購(gòu)自北京BioVector NTCC公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本東仁公司。倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，馬爾文粒徑分析儀購(gòu)自英國(guó)Malvern公司，UV-2550紫外分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Agilent公司，Sonics & Materials聲振儀購(gòu)自美國(guó)Sonic公司，808 nm激光儀購(gòu)自西安中川光電科技有限公司，Mylab 90超聲診斷儀購(gòu)自意大利百勝公司，光聲成像儀購(gòu)自加拿大Visual Sonics公司，透射電子顯微鏡購(gòu)自日本Hitachi公司，熱成像儀購(gòu)自上海Fotric公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BDInflux公司。

1.2 IR-820/PFP@PLGA納米粒的制備及基本表征檢測(cè)

1.2.1 納米粒的制備 將2 ml濃度為25 mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液、1 ml濃度為2 mg/ml IR-820水溶液、200 ml PFP混合，用聲振儀聲振3 min后，加入5 ml 5% PVA水溶液，再聲振3 min后，用磁力攪拌器攪拌4 h，使二氯甲烷充分揮發(fā)。最后用低溫離心機(jī)離心洗滌至上清澄清后獲得IR-820/PFP@PLGA納米粒，4 ℃保存?zhèn)溆?。制備全過(guò)程避光冰浴。

1.2.2 納米粒的基本表征檢測(cè) 將IR-820/PFP@PLGA納米粒用去離子水重懸，稀釋100倍后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)及分布，透射電子顯微鏡觀察納米粒的微觀形態(tài)；馬爾文粒徑儀及Zeta電位分析儀檢測(cè)其粒徑及電位；紫外分光光度計(jì)記錄IR-820的吸收光譜并以最高吸收峰繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)納米粒IR-820包封率及載藥量。納米粒IR-820包封率(%)=(投入IR-820總量－上清液中IR-820量)/投入IR-820總量×100%；載藥量(%)=(投入IR-820總量－上清液中IR-820量)/納米?？偭俊?00%。

1.3 IR-820/PFP@PLGA納米粒體外熱致相變及光熱效應(yīng) 納米粒的熱致相變：取適量稀釋100倍的納米粒于載玻片上，用加熱板加熱至不同溫度(25、45、50、55、60 ℃)，倒置顯微鏡(×100)下觀察納米粒的變化情況。納米粒的光熱效應(yīng)：采用808 nm激光(1 W/cm2、5 min)分別輻照不同濃度(31.25、62.5、125、250 μg/ml)納米粒溶液，以PBS為對(duì)照，采用熱成像儀監(jiān)測(cè)溫度變化。同時(shí)為探討納米粒中不同成分的升溫情況，設(shè)置對(duì)照組(PBS)、PFP@PLGA組(PLGA濃度為10 mg/ml)、IR-820組(IR-820濃度為250 μg/ml)、IR-820/PFP@PLGA組，采用熱成像儀監(jiān)測(cè)各組的溫度變化。

1.4 IR-820/PFP@PLGA納米粒體外超聲/光聲成像觀察

1.4.1 超聲成像 將PBS、IR-820溶液(IR-820濃度為250 μg/ml)及IR-820/PFP@PLGA納米粒溶液(IR-820濃度為250 μg/ml)分別注入3%瓊脂凝膠模型中，采用超聲診斷儀檢測(cè)超聲輻照前后的超聲成像效果，并用DFY組織灰度檢測(cè)軟件測(cè)量分析灰度值。

1.4.2 光聲成像 將不同濃度(31.25、62.5、125、250、500 μg/ml)IR-820/PFP@PLGA納米粒溶液注于3%瓊脂凝膠模型中，用Vevo LAZR 光聲成像儀檢測(cè)激光輻照前后各組的光聲成像效果，并對(duì)光聲信號(hào)進(jìn)行定量分析。

1.5 IR-820/PFP@PLGA納米粒活性氧生成能力檢測(cè) 將含50×10-6SOSG的不同濃度(0、31.25、62.5、125、250 μg/ml)IR-820/PFP@PLGA納米粒的3 ml溶液加入10 ml EP管內(nèi)，并用1.0 W/cm2的激光輻照3 min，采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光值(激發(fā)波長(zhǎng)504 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)；為探索納米粒產(chǎn)生活性氧的含量與激光輻照時(shí)間是否具有相關(guān)性，將含有50×10-6SOSG的濃度為250 μg/ml的IR-820/PFP@PLGA納米粒用1.0 W/cm2的激光輻照不同時(shí)間(0、30、60、90、120、150 s)，采用熒光分光光度計(jì)記錄其熒光值。

1.6 IR-820/PFP@PLGA納米粒對(duì)FLSs活性的影響MH7A FLSs用含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)均使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。將MH7A細(xì)胞于96孔板鋪板(1×104個(gè)/孔)，設(shè)置對(duì)照組(PBS)及不同濃度納米粒組(31.25、62.5、125、250 μg/ml)。細(xì)胞孵育至貼壁后換成100 μl含有不同濃度納米粒的新鮮培養(yǎng)液(n=5)繼續(xù)孵育24 h，加入含有10% CCK-8的無(wú)血清培養(yǎng)液孵育4 h，采用酶標(biāo)儀記錄450 nm波長(zhǎng)處的的吸光度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 激光介導(dǎo)的IR-820/PFP@PLGA納米粒對(duì)FLSs的光動(dòng)力治療作用 納米粒光動(dòng)力作用對(duì)細(xì)胞活性的影響采用CCK-8法檢測(cè)。除加入不同納米粒進(jìn)行激光輻照(1 W/cm2，90 s)處理外，其余過(guò)程與1.6相同。通過(guò)對(duì)納米粒體外熱效應(yīng)及活性氧生成能力的分析，最終實(shí)驗(yàn)選用納米粒濃度250 μg/ml、激光(1 W/cm2)輻照90 s的條件進(jìn)行光動(dòng)力治療。將MH7A細(xì)胞接種于12孔板，實(shí)驗(yàn)分為四組(n=3)：(1)對(duì)照組；(2)單純激光組；(3)IR-820/PFP@PLGA納米粒組(濃度為250 μg/ml；(4)IR-820/PFP@PLGA納米粒(濃度為250 μg/ml)+激光組。待細(xì)胞貼壁后，加入PBS或納米粒共孵育24 h，用PBS沖洗未結(jié)合的納米粒，加入等量新鮮培養(yǎng)液后進(jìn)行激光輻照(1 W/cm2，90 s)，孵育24 h后收集細(xì)胞，Annexin V-FITC/PI雙染5 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IR-820/PFP@PLGA納米粒的基本特征 IR-820/PFP@PLGA納米粒液肉眼呈墨綠色乳液，光鏡下可見(jiàn)納米粒大小均勻、分散性較好(圖1A)，透射電鏡可見(jiàn)納米粒呈類(lèi)圓形黑色球體(圖1B)。馬爾文粒徑儀檢測(cè)結(jié)果顯示，IR-820/PFP@PLGA納米粒粒徑為(261.8±3.2) nm(圖1C)，電位為(-27.4±0.7) mV；紫外分光光度計(jì)見(jiàn)IR-820在680 nm處具有明顯的吸收峰，通過(guò)不同濃度的IR-820溶液在680 nm處的吸光度，繪制IR-820的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.068X+0.029，R2=0.997(圖1D、E)。并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出納米粒IR-820的包封率為72.15%±0.43%，載藥量為7.61%±0.63%。

圖1 IR-820/PFP@PLGA納米粒的基本特征Fig.1 Basic characterization of IR-820/PFP@PLGA nanoparticles

2.2 IR-820/PFP@PLGA納米粒的熱致相變及光熱效應(yīng) 光鏡觀察到常溫(25 ℃)時(shí)納米粒溶液呈均勻的點(diǎn)狀納米顆粒，隨著溶液溫度上升，可見(jiàn)納米顆粒逐漸變成納米微泡，即納米粒包載的PFP發(fā)生熱致相變(圖2A)。通過(guò)熱紅外成像儀記錄用808 nm激光輻照的不同濃度納米粒，可見(jiàn)經(jīng)激光輻照后納米粒溶液的溫度隨其濃度增高而增加，溶液溫度最高可達(dá)到50 ℃以上，說(shuō)明體外激光輻照能激發(fā)納米粒發(fā)生液氣相變(PFP相變29 ℃左右，圖2B)。熱紅外成像結(jié)果顯示，IR-820組、IR-820/PFP@PLGA組激光輻照后溶液出現(xiàn)類(lèi)似溫度升高，從側(cè)面證實(shí)納米粒成功包載了IR-820(圖2C)。

圖2 IR-820/PFP@PLGA納米粒熱相變及光熱效應(yīng)觀察(n=3)Fig.2 Thermal phase transition and photothermal effect of IR-820/PFP@PLGA nanoparticles (n=3)

2.3 IR-820/PFP@PLGA納米粒體外超聲/光聲雙模態(tài)成像 超聲診斷儀成像顯示，對(duì)照組、IR-820溶液組及IR-820/PFP@PLGA組在激光輻照前的超聲及造影模式均呈低回聲信號(hào)。激光輻照后，對(duì)照組、IR-820溶液組的超聲和造影模式圖像仍呈低回聲信號(hào)，僅IR-820/PFP@PLGA納米粒的超聲和造影模式圖像回聲信號(hào)明顯增強(qiáng)，DFY軟件定量測(cè)量顯示了相同的結(jié)果(圖3A-C)。同時(shí)，光聲成像儀可觀察到納米粒的光聲信號(hào)隨納米粒的濃度升高而增強(qiáng)，定量分析顯示兩者呈線性關(guān)系(圖3D)。

圖3 體外IR-820/PFP@PLGA納米粒超聲/光聲成像觀察(n=3)Fig.3 Ultrasound/photoacoustic imaging of IR-820/PFP@PLGA nanoparticles in vitro (n=3)

2.4 IR-820/PFP@PLGA納米粒的活性氧生成能力檢測(cè)結(jié)果 已知SOSG在體外與活性氧結(jié)合會(huì)生成SOSG-EP，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度值增加。激光輻照后，SOSG的熒光值隨納米粒濃度升高而增加(P<0.05，圖4A)。同時(shí)，當(dāng)納米粒濃度固定時(shí)(如250 μg/ml)，SOSG的熒光值隨激光輻照時(shí)間延長(zhǎng)而增加(圖4B)。

圖4 IR-820/PFP@PLGA納米?；钚匝跎赡芰z測(cè)結(jié)果(n=3)Fig.4 Reactive oxygen species of IR-820/PFP@PLGA nanoparticles (n=3)

2.5 IR-820/PFP@PLGA納米粒對(duì)FLSs活性的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度(31.25、62.5、125、250 μg/ml)納米粒作用24 h后FLSs的細(xì)胞活性與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖5A)。

2.6 激光介導(dǎo)IR-820/PFP@PLGA納米粒對(duì)FLSs光動(dòng)力治療作用觀察 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)激光輻照后，F(xiàn)LSs的細(xì)胞活性隨納米粒濃度升高呈下降趨勢(shì)，當(dāng)納米粒濃度為250 μg/ml時(shí)，細(xì)胞活性約為對(duì)照組的55%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5B)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，IR-820/PFP@PLGA+激光組細(xì)胞凋亡率為40.66%，而對(duì)照組、單純激光組和IR-820/PFP@PLGA組均未見(jiàn)明顯的細(xì)胞凋亡(圖5C)。

圖5 IR-820/PFP@PLGA納米粒的光動(dòng)力治療結(jié)果Fig.5 The photodynamic therapeutic effect of IR-820/PFP@PLGA nanoparticles

3 討 論

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理改變主要為受累關(guān)節(jié)滑膜組織增殖及炎癥破壞，其治療目標(biāo)為阻斷或延緩滑膜炎癥增生的病理生理過(guò)程[12-14]。RA病程進(jìn)展的主要原因是具有類(lèi)似腫瘤細(xì)胞的高增殖率、侵襲、遷移及抗凋亡特征的FLSs[15]過(guò)度增殖，因此早期監(jiān)測(cè)及干預(yù)FLSs的異常增殖對(duì)緩解甚至治愈RA具有重要意義。IR-820為吲哚菁綠的類(lèi)似物，被稱(chēng)為新吲哚菁綠，具有良好的光聲成像、光熱效應(yīng)及光動(dòng)力效應(yīng)，可用于疾病的光聲成像診斷及PDT治療研究。同時(shí)，PFP(沸點(diǎn)為29 ℃)可隨溫度升高由液態(tài)相變?yōu)闅鈶B(tài)，是近年來(lái)超聲造影劑研究的重點(diǎn)，被大量用于增強(qiáng)超聲成像研究。光動(dòng)力治療[16]的原理是某種光敏劑在特定波長(zhǎng)的激光輻照后產(chǎn)生活性氧，可殺傷FLSs細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)FLSs的凋亡。但由于目前RA的影像學(xué)診斷方式主要以單一成像模式為主，對(duì)早期病變的診斷準(zhǔn)確性不高，因此，探索多模態(tài)分子成像[17]對(duì)診斷RA具有重要意義。

本研究制備的I R-8 2 0/P F P@P LG A 納米粒具有光熱效應(yīng)及光動(dòng)力效應(yīng)，且能夠增強(qiáng)超聲成像和光聲成像能力，對(duì)RA體外模型中的FLSs細(xì)胞具有光動(dòng)力殺傷作用。本研究結(jié)果顯示，IR-820/PFP@PLGA納米粒在溶液中呈墨綠色，大小均一，形態(tài)規(guī)則，粒徑為(261.8±3.2) nm，電位為(-27.4±0.7) mV；納米粒IR-820包封率為72.15%±0.43%，載藥量為7.61%±0.63%。體外熱致相變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米粒顆?？呻S外界溫度升高而發(fā)生液氣相變，體積逐漸增大；同時(shí)，體外光熱效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，納米粒濃度為250 μg/ml、激光輻照約100 s，納米粒溫度可達(dá)到50 ℃并維持5 min，足以使納米粒包載的PFP熱致相變，呈現(xiàn)增強(qiáng)超聲成像能力，可用于疾病的光熱治療。雖然RA滑膜炎病變類(lèi)似于腫瘤，但考慮到滑膜異常增生及炎癥激活表型的滑膜組織與周?chē)＝M織邊界不太清晰，以及光熱效應(yīng)[18]可能對(duì)周?chē)＝M織細(xì)胞活性產(chǎn)生不利影響，本研究通過(guò)控制激光輻照時(shí)間盡量降低納米粒的光熱效應(yīng)。體外活性氧生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納米?；钚匝跎闪颗c納米粒濃度及激光輻照時(shí)間呈正相關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)納米粒濃度為250 μg/ml時(shí)，激光輻照3 min的熒光值稍高于輻照5 min的熒光值，這可能與熒光淬滅有關(guān)。

通過(guò)納米粒體外雙模態(tài)成像和光動(dòng)力治療研究發(fā)現(xiàn)，激光輻照后納米粒光聲成像效果與其濃度呈線性關(guān)系，納米粒的B型超聲、增強(qiáng)超聲成像效果較對(duì)照組及輻照前明顯增強(qiáng)。納米粒FLSs細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單純納米粒與FLSs細(xì)胞孵育24 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明該納米粒在體外對(duì)滑膜細(xì)胞具有較高的生物安全性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然而，納米粒組經(jīng)激光輻照90 s后細(xì)胞活性呈下降趨勢(shì)，當(dāng)納米粒濃度為250 μg/ml時(shí)，細(xì)胞活性已降低至55%。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，激光介導(dǎo)納米粒組的細(xì)胞凋亡率達(dá)40.66%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究采用雙乳化法成功制備出包載PFP[19]和IR820[20]的PLGA納米粒(IR820/PFP@PLGA)，在激光輻照后可使局部溫度升高，從而增強(qiáng)超聲成像能力，同時(shí)激光與IR820作用可產(chǎn)生具有殺傷作用的活性氧，促進(jìn)FLSs細(xì)胞的凋亡。但若想將該納米粒應(yīng)用于臨床仍然面臨諸多問(wèn)題。首先是納米粒在體內(nèi)的安全性，如是否會(huì)在體內(nèi)聚集形成栓塞或者引起肝腎衰竭等；其次是納米粒的靶向性，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的納米粒表面未連接相關(guān)配體[21]，即使應(yīng)用到體內(nèi)也主要是利用局部病理組織的高滲透長(zhǎng)滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)[22]，缺乏靶向特異性。因此，在后續(xù)的研究中可探索將相應(yīng)的配體連接到納米粒表面，以提高納米粒的靶向特異性，并確保其良好的體內(nèi)生物安全性，為RA的診療提供新的思路。