連續(xù)萃取法從花生殼中提取木犀草素的研究

馮亞莉，曹智威，顧悅馨，賈洋洋，郝煥煥，付潔浩，翟廣玉

（鄭州工業(yè)應用技術(shù)學院藥學與化學工程學院，河南 鄭州 451100）

木犀草素（3′，4′，5，7-四羥基黃酮）是一種最為常見的天然黃酮類物質(zhì)，廣泛存在于多種植物中，如金銀花、菊花、白毛夏枯草等天然藥物和芹菜、甜椒、辣椒、落花生等蔬菜果實中[1]。作為一種天然的抗氧化劑，木犀草素具有多種顯著的生物活性，如抗癌[2-6]、抗菌、抗炎[8-10]、保護心血管[11]、改善和治療阿爾茨海默癥[12-13]等，具有廣泛的醫(yī)藥價值和應用前景。目前，國內(nèi)多以白毛夏枯草等為原料生產(chǎn)木犀草素，價格高，收益率低。木犀草素化學結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 木犀草素的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of luteolin

花生殼中富含木犀草素，是木犀草素的理想來源之一[14]。花生是一年生草本植物，是世界上重要的五大油料作物之一，其生產(chǎn)遍及世界各地[15]。我國是花生生產(chǎn)、消費和出口貿(mào)易最大的國家，每年花生殼的產(chǎn)量高達500萬噸[16]。鄭州市位于河南省中部，經(jīng)濟作物主要以花生為主，花生加工業(yè)每年產(chǎn)出大量的花生殼，僅有少量用作飼料或化工原料，其余大部分被用于燃料或當作廢棄物處理，既嚴重污染環(huán)境，又造成資源的極大浪費。因此，開發(fā)利用花生殼中的有效成分木犀草素等天然黃酮類化合物，對于有效延長花生產(chǎn)業(yè)鏈，提高花生資源綜合利用效益，具有重要的社會意義。

歸納近幾年相關(guān)研究報道，提取花生殼中木犀草素的方法主要有水浴回流法[17]、有機溶劑提取法[18-19]、堿水提取法[20]，輔助方法主要有微波輔助提取技術(shù)[21]、超聲輔助提取技術(shù)[22]、超臨界流體萃取技術(shù)[23]及生物酶解技術(shù)[24]、離子液提取技術(shù)[25]等。傳統(tǒng)的水浴回流法、有機溶劑提取法及堿水提取法等存在得率較低的問題，微波輔助法和超聲波輔助法能耗和成本較高，酶提取法及離子液提取技術(shù)操作繁瑣，不適于工業(yè)生產(chǎn)。

本文采用連續(xù)萃取法提取花生殼中的木犀草素，考察不同萃取劑、萃取劑體積分數(shù)、萃取劑用量、萃取溫度及萃取時間等因素對木犀草素提取率的影響，考察石油醚脫脂預處理對提取的花生殼中木犀草素純度的影響，采用高效液相色譜法對花生殼中木犀草素的提取率及產(chǎn)品純度進行測定。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

木犀草素標準品（98%）：上海麥克林生化科技有限公司；花生殼：花生果產(chǎn)于河南省鄭州市，手工剝殼，洗凈后60℃干燥箱烘干，粉碎備用；甲醇：色譜級，天津市科密歐化學試劑有限公司。其它所用試劑均為分析純。

萃取器：鄭州市高等學校生藥學名師技術(shù)技能工作室自制；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HJ-3型恒溫磁力加熱攪拌器：常州翔天實驗儀器廠；SQP型分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵：天津華鑫儀器廠；ZW-3型紫外分析儀：鞏義市予華儀器有限責任公司；FW-100型藥用植物粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；Agilent-1260型高效液相色譜儀、Zorbax SB型C18色譜柱（4.6 mm×4 250 mm，5 μm）：美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

稱取100 g過40目篩的花生殼干粉于1 000 mL燒杯中，加入500 mL石油醚，攪拌密封放置24 h進行脫脂處理。過濾，石油醚回收，花生殼自然揮干24 h。將揮干后的花生殼置于萃取器中，加入2 000 mL 75%乙醇，在萃取器中加熱回流，控制溫度為80℃，連續(xù)提取2 h。立即切換另一個新的已經(jīng)裝好花生殼干粉的萃取器，開始新一輪的連續(xù)萃取。

提取完成后，旋蒸濃縮提取液至浸膏狀，加入10倍體積的蒸餾水，靜置后取沉淀，置于50℃恒溫干燥箱烘干，得粗提物。然后依次加入適量的無水乙醇、丙酮，使其完全溶解，過濾，石油醚進行二次脫脂，脫脂完成后加入適量乙酸乙酯再次重結(jié)晶，干燥，得到木犀草素供試樣品。

1.3 薄層層析（thin layer chromatography，TLC）鑒定

取適量木犀草素標準品、木犀草素供試品用無水乙醇溶解，以氯仿-甲醇-冰乙酸（9∶0.5∶0.5，體積比）的混合溶液為展開劑，置于紫外燈下（365 nm）檢視。

1.4 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定

1.4.1 溶液配制

標準品溶液：精密稱取木犀草素標準品1.00 mg，取適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲混勻，得濃度為1 mg/mL木犀草素標準品溶液[26]。

供試品溶液：精密稱取木犀草素供試品1.00 mg，取適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲混勻，得1 mg/mL的供試品溶液[26]。

1.4.2 色譜條件選擇

色譜柱：Zorbax SB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.5%磷酸溶液（體積比，70∶30），流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長（λ）∶348 nm。

1.4.3 線性關(guān)系考察和花生殼中木犀草素含量測定

準確量取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 木犀草素標準品溶液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按“1.4.2”色譜條件依次進樣分析，平行測定5次，取平均值。以木犀草素標準品濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y）繪制標準曲線，建立回歸方程。

對木犀草素供試品溶液進樣測定，測定結(jié)果代入回歸方程計算木犀草素的濃度，并按照下列公式計算木犀草素供試品純度ω和木犀草素的提取率W。

式中：n為稀釋倍數(shù)；c為供試品溶液的濃度，mg/mL；V為供試品溶液的體積，mL；m1為稱取的木犀草素供試品質(zhì)量，mg。

式中：m2為提取的木犀草素產(chǎn)品總質(zhì)量，mg；m為試驗稱取的花生殼質(zhì)量，g；ω為木犀草素供試品純度，%。

1.4.4 精密度試驗

對同一木犀草素標準品溶液重復進樣8次，進樣體積為20 μL，計算峰面積的相對標準偏差（rlative sandard deviation，RSD）。

1.4.5 穩(wěn)定性試驗

對同一木犀草素供試品溶液12 h內(nèi)每隔1 h進樣測定1次，進樣體積為20 μL，計算峰面積的RSD。

1.4.6 重復性試驗

對同一木犀草素供試品溶液重復進樣5次，進樣體積為20 μL，計算峰面積的RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層層析鑒定結(jié)果

薄層層析鑒定結(jié)果如圖2所示。

圖2 TLC分析Fig.2 TLC analysis

在紫外燈檢視下發(fā)現(xiàn)，標準品與供試品溶液在同一硅膠G薄層層析板相同位置顯示相同顏色斑點。

2.2 木犀草素含量測定結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系試驗

以色譜峰面積（Y）對木犀草素標準品濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=29538X+380.98（r=0.9974），線性關(guān)系良好。在本試驗的色譜條件下，木犀草素的保留效果較好，出峰時間約為3.8 min，分析時間較短，有利于快速分析。木犀草素標照品的HPLC圖見圖3，木犀草素供試品的HPLC圖見圖4。

圖3 木犀草素標準品色譜圖Fig.3 Chromatogram of luteolin standard product

圖4 木犀草素供試品色譜圖Fig.4 Chromatogram of luteolin test product

2.2.2 精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗結(jié)果

精密度試驗測得木犀草素的峰面積RSD為0.62%（n=8），表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗測得木犀草素的峰面積RSD為0.64%（n=12），表明木犀草素供試品溶液在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性；重復性試驗測得木犀草素的峰面積RSD為0.13%（n=5），表明該方法重現(xiàn)性良好，在測定過程中木犀草素供試品溶液能夠保持穩(wěn)定。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 石油醚脫脂預處理對花生殼中木犀草素產(chǎn)品純度的影響

固定料液比為1∶20（g/mL），萃取溫度為80℃，萃取時間為2.0 h，考察石油醚脫脂預處理對花生殼提取物中木犀草素產(chǎn)品純度的影響，試驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 石油醚脫脂預處理對花生殼中木犀草素純度的影響Fig.5 Effect of petroleum ether degreasing pretreatment on the purity of luteolin in peanut shells

結(jié)果顯示，石油醚脫脂預處理后，花生殼提取物中木犀草素產(chǎn)品的純度可達到67.86%，而未經(jīng)石油醚脫脂預處理的花生殼提取物中木犀草素產(chǎn)品的純度僅為10.05%?；ㄉ鷼さ闹饕煞质前肜w維素和粗纖維素，另有粗蛋白、粗脂肪、糖類、黃酮類物質(zhì)及礦物質(zhì)成分等[27]。其中粗蛋白含量為4.8%～7.2%，粗脂肪含量為1.2%～1.8%[28]，主要是油脂類成分及脂肪烷烴類成分，如二十六烷酸-α-單甘油酯、十八烷酸-α-單甘油酯、十六烷酸-α-單甘油酯、正二十六碳酸乙酯、磷脂等。采用石油醚密封浸泡攪拌預處理可除去花生殼中大量的粗蛋白、粗脂肪、木犀草素苷等低極性雜質(zhì)，從而提高木犀草素產(chǎn)品的純度。

2.3.2 不同萃取劑對花生殼中木犀草素提取率的影響

采用石油醚對花生殼脫脂預處理24 h，固定料液比為1∶20（g/mL），萃取溫度為80℃，萃取時間為2.0h，考察不同萃取劑對花生殼提取物中木犀草素提取率的影響。分別選用75%乙醇溶液、75%甲醇溶液、75%丙酮溶液、乙酸乙酯、0.2 mol/L NaOH溶液以及水作為萃取劑進行提取，試驗結(jié)果如表1所示。

表1 不同萃取劑花生殼提取物中木犀草素的提取率和純度Table 1 Luteolin extraction rate and purity of peanut shell extracts with different extractants

從表1中可以看出，各萃取劑對花生殼中木犀草素提取率的影響順序為：水＞75%乙醇溶液＞75%丙酮溶液＞75%甲醇溶液＞0.2 mol/L NaOH溶液＞乙酸乙酯，而提取物中木犀草素產(chǎn)品純度大小為：75%丙酮溶液＞75%乙醇溶液＞75%甲醇溶液＞0.2 mol/L NaOH溶液＞乙酸乙酯＞水。而根據(jù)價格、性能、來源、對環(huán)境的影響等綜合考慮，選擇乙醇溶液作為萃取劑比較合適。

2.3.3 乙醇溶液體積分數(shù)對花生殼中木犀草素提取率的影響

采用石油醚對花生殼脫脂預處理24 h，固定料液比為1∶20（g/mL），萃取溫度為 80℃，萃取時間為2.0h，考察乙醇溶液體積分數(shù)（45%、55%、65%、75%、85%、90%）對花生殼提取物中木犀草素提取率的影響，試驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 乙醇溶液體積分數(shù)對花生殼中木犀草素提取率的影響Fig.6 Effect of ethanol solution volume fraction on extraction rate of luteolin from peanut shell

從圖6中可以看出，當乙醇溶液體積分數(shù)低于75%時，花生殼中木犀草素提取率隨乙醇溶液體積分數(shù)的增大而提高，而當乙醇溶液體積分數(shù)達到85%、90%時，木犀草素提取率呈緩慢下降趨勢。這是由于木犀草素母核是由兩個具有酚羥基的苯環(huán)通過一個成環(huán)的C3相互連接而成，是一種弱極性化合物，因此易溶于乙醇。同時木犀草素還是一種平面性較強的分子，各個分子間排列緊密，引力較大，故難溶于水。因此，根據(jù)相似相溶原理，木犀草素的溶解度隨萃取劑中乙醇含量的升高而增大。但是，當乙醇含量過高，即超過75%時，導致萃取劑極性過低，也不利于木犀草素的提取。因此，當乙醇溶液體積分數(shù)為75%時，萃取效果較好。

2.3.4 料液比對花生殼中木犀草素提取率的影響

采用石油醚對花生殼脫脂預處理24 h，固定萃取溫度為80℃，萃取時間為2.0 h，乙醇溶液體積分數(shù)為75%，考察料液比為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1：25、1∶30（g/mL）時對花生殼中木犀草素提取率的影響，試驗結(jié)果如圖7所示。

從圖7可以看出，木犀草素提取率隨萃取劑用量的增大而提高，在 1∶5（g/mL）～1∶20（g/mL）區(qū)間時，木犀草素的提取率增加較快，而當料液比大于1∶20（g/mL）時，木犀草素提取率的增加趨勢比較緩慢。因此，選擇料液比為 1∶20（g/mL）。

圖7 料液比對花生殼中木犀草素提取率的影響Fig.7 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of luteolin from peanut shell

2.3.5 萃取溫度對花生殼中木犀草素提取率的影響

采用石油醚對花生殼脫脂預處理24 h，固定料液比為1∶20（g/mL），萃取時間為2.0 h，乙醇溶液體積分數(shù)為 75%，考察萃取溫度（40、50、60、70、80、85、90 ℃）對花生殼中木犀草素提取率的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 萃取溫度對花生殼中木犀草素提取率的影響Fig.8 Effect of extraction temperature on extraction rate of luteolin from peanut shell

從圖8可以看出，萃取溫度對花生殼中木犀草素提取率的影響很明顯。當萃取溫度低于80℃時，木犀草素提取率隨溫度的升高而增加，而當萃取溫度高于80℃時，木犀草素提取率隨溫度的升高反而有所降低。這是由于在乙醇溶液提取木犀草素的過程中，溫度既影響溶質(zhì)在溶劑中的溶解速度，又影響溶質(zhì)向外擴散的速度。另外，溫度的升高也會提高木犀草素在萃取劑中的溶解度。但是由于木犀草素為黃酮類化合物，對熱比較敏感，高溫會加速其氧化，所以萃取溫度也不是越高越好。當萃取溫度為80℃左右時，萃取效果較好。

2.3.6 萃取時間對花生殼中木犀草素提取率的影響

采用石油醚對花生殼脫脂預處理24 h，固定料液比為1∶20（g/mL），萃取溫度為80℃，乙醇溶液體積分數(shù)為 75%，考察萃取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對花生殼提取物中木犀草素提取率的影響，結(jié)果如圖9所示。

圖9 萃取時間對花生殼中木犀草素提取率的影響Fig.9 Effect of extraction time on extraction rate of luteolin from peanut shell

從圖9可以看出，隨著萃取時間的增加，花生殼中木犀草素的提取率也增加，但是當時間超過2.0 h時，木犀草素的提取率呈降低趨勢。這是由于長時間的加熱會造成木犀草素受熱氧化，從而使得木犀草素提取率降低，因此，選擇萃取時間為2.0 h效果較好。

3 結(jié)論

采用連續(xù)萃取法從花生殼中提取木犀草素，節(jié)省溶劑，操作簡單，工藝流程短，提取率高，含雜質(zhì)少，殘渣少，耗能小，符合綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展原則，經(jīng)濟和社會效益顯著，具有省工省時，便于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點。本試驗結(jié)果表明，使用石油醚對花生殼進行脫脂預處理，以75%乙醇溶液為萃取劑，采用連續(xù)萃取法從花生殼中提取木犀草素，料液比為1∶20（g/mL），萃取溫度為80℃，萃取時間為2.0 h時，提取率可達到0.32 mg/g，純度可達到67.86%，可明顯增加花生殼提取物中木犀草素的提取率。

花生殼資源的綜合利用屬于典型的低碳經(jīng)濟。鄭州市花生種植面積大，產(chǎn)量高，花生殼資源豐富，價格低廉，但回收利用較少，造成自然資源的浪費及一定程度的環(huán)境污染。本研究旨在為花生殼中木犀草素的生產(chǎn)提供參考，使花生殼資源得到綜合利用，同時也能獲得良好的經(jīng)濟效益和社會效益，具有廣闊的開發(fā)前景和重要的社會價值。