絲瓜葉提取物凝膠劑的制備及生物活性研究

陳霓平，蔡浛，陳澤豐，卞旺青，王亞坤，張紫菱，張焜，何燕

（廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

絲瓜葉為葫蘆科絲瓜屬植物絲瓜（Luffa cylinderi Roem）的葉，又名虞刺葉，出自《滇南本草》，《全國中草藥匯編》、《中藥大辭典》和《中華本草》中均有記載?！兜崮媳静荨分杏涊d“葉，曬干為末，治絞腸痧”[1]?！度珖胁菟巺R編》記載，絲瓜葉味苦、酸，微寒，具有止血、清熱解毒和化痰止咳等功效，內(nèi)服用于百日咳，咳嗽，暑熱口渴；外用治創(chuàng)傷出血，疥癬，天皰瘡[2]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，絲瓜提取物在抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫、腦缺血損傷、改善認(rèn)知障礙等方面有一定的藥理活性[3-6]。絲瓜葉中含有三萜皂苷、總黃酮、揮發(fā)油、酚類等活性成分[7-8]。日本已將絲瓜皂苷與絞股藍(lán)皂苷合用，做成含人參皂苷且具有人參功能的食品應(yīng)用于臨床[9]。絲瓜葉中黃酮是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，可有效阻止細(xì)胞的退化、衰老，也有較好的抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素的生成[10]具有美白功效，是絲瓜葉的主要活性成分。

凝膠劑是經(jīng)皮給藥新劑型，具有涂抹性好、無油膩感、皮膚表面停留時(shí)間長、透皮吸收速度快、使用方便等優(yōu)點(diǎn)[11]。目前市場(chǎng)上絲瓜葉的相關(guān)產(chǎn)品較少，為進(jìn)一步開發(fā)和利用絲瓜葉資源，將絲瓜葉制備成凝膠劑，通過體外局部給藥，以期達(dá)到抑菌、抗氧化等效果。本研究采用榨汁-噴霧干燥法獲得絲瓜葉提取物，選取水性凝膠基質(zhì)制備絲瓜葉外用凝膠，使絲瓜葉凝膠有良好的生物相容性，穩(wěn)定性，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)及活性研究，為絲瓜葉的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絲瓜葉（食用級(jí)）：山東千草有限公司；蘆丁對(duì)照品：北京萬佳首化生物科技有限公司；卡波姆940（藥用級(jí)）：廣州美懿生物科技有限公司。以下試劑為分析純，亞硝酸鈉：天津市廣成化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉（顆粒）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；胰蛋白胨、酵母膏：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PEG-40氫化蓖麻油、三乙醇胺、氯化鈉：廣州化學(xué)試劑廠；硝酸鋁、氫氧化鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；枯草芽孢桿菌（B.cereus）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌（E.coli）：廣州微生物研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6090真空干燥箱、DZF-6090型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PE-Lambda25紫外可見分光光度計(jì)：美國鉑金埃爾默公司；ADL311噴霧干燥器：重慶雅馬拓科技有限公司；FE20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Mk3酶標(biāo)儀：芬蘭雷勃公司；SN510C型立式壓力蒸汽滅菌器：重慶雅馬拓科技有限公司。

1.3 制備絲瓜葉凝膠

將新鮮絲瓜葉稱重切碎榨汁得絲瓜葉糊，再將其煮沸，冷卻過濾即得絲瓜葉原汁。絲瓜葉原汁加去離子水稀釋，進(jìn)行噴霧干燥，得到絲瓜葉提取物。噴霧干燥器相關(guān)參數(shù)：入口溫度140℃、蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速2檔、風(fēng)機(jī)轉(zhuǎn)速4檔、壓力0.1 MPa。

根據(jù)配方精密稱取卡波姆940于容器中，滴加甘油研磨至黏稠狀，加入適量純化水靜置溶脹24 h，另取絲瓜葉粉用水溶解，與PEG-40氫化蓖麻油、尼泊金乙酯、丁二醇分別加入凝膠基質(zhì)中，攪勻；滴加適量三乙醇胺至pH6.0～8.0，加水?dāng)嚢璩尚?，即得絲瓜葉凝膠。凝膠配方見表1。

表1 凝膠配方Table 1 Gel formula

1.4 總黃酮含量測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

精密稱取10.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用60%乙醇溶解、定容配制成濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.4.2 供試品溶液

稱取10.0 g絲瓜葉凝膠（其中絲瓜葉粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，即包含絲瓜葉粉0.3 g）用適量60%乙醇超聲溶解、定容，得供試品絲瓜葉凝膠溶液，備用。

1.4.3 空白對(duì)照品溶液

按凝膠配方制備空白凝膠（不含絲瓜葉提取物），根據(jù)“1.4.2”項(xiàng)下方法制備得空白凝膠溶液。

1.4.4 最大吸收波長測(cè)定

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、絲瓜葉凝膠溶液和空白凝膠溶液各1mL分別置于10 mL具塞試管中。加入4 mL 60%乙醇和1 mL 1∶9的Al（NO3）3現(xiàn)配溶液，搖勻，室溫（25℃）下靜置6 min（顯色處理），用60%乙醇定容至10 mL靜置10 min。以無水乙醇作空白溶液，在紫外可見分光光度計(jì)上掃描300 nm～700 nm波長，以確定最大吸收波長。

1.4.5 線性考察

精密吸取0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于 10 mL 具塞試管中，顯色處理，定容至10mL，于最大吸收波長處測(cè)定光密度（OD）值，也稱為吸光度。以吸光度A對(duì)質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.6 精密度試驗(yàn)

精密量取6份供試品溶液1 mL，置于10 mL具塞試管中，顯色處理后，在最大吸收波長最大吸收處測(cè)定OD值，計(jì)算相對(duì)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.4.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取10 g同一批絲瓜葉凝膠共6份，按“1.4.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，各取1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，顯色處理后，在最大吸收波長處測(cè)定OD值，計(jì)算RSD。

1.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將1 mL供試品溶液加入10 mL具塞試管中，經(jīng)顯色處理后，在最大吸收波長處每隔10 min測(cè)定一次OD值，共12次，計(jì)算RSD。

1.4.9 加樣回收試驗(yàn)

精確量取6份供試品溶液1.0 mL，分別向其中滴加 0.1mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，顯色處理，在最大吸收波長處測(cè)定OD值，計(jì)算回收率。

1.4.10 含量測(cè)定

分別稱取3批絲瓜葉凝膠各10 g，按照“1.4.2”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，顯色處理后，在最大吸收波長處測(cè)定OD值，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算絲瓜葉凝膠溶液中總黃酮的含量。

1.5 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將樣品進(jìn)行高溫試驗(yàn)、高濕試驗(yàn)、暴露于空氣、離心試驗(yàn)試驗(yàn)，對(duì)絲瓜葉外用凝膠劑的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，確保其質(zhì)量可控與安全，符合中國藥典的相關(guān)規(guī)定。

分別取3批10g絲瓜葉凝膠置于玻璃皿，進(jìn)行10d的高溫（60℃）、高濕[相對(duì)濕度（relative humidity，RH）為92.5%]、暴露空氣影響因素試驗(yàn)，于0、5、10 d取樣檢測(cè)絲瓜葉凝膠的質(zhì)量、外觀性狀、活性成分含量。取3批絲瓜葉凝膠10.0 g于3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理30 min，觀察絲瓜葉凝膠形態(tài)及顏色變化，考察其性狀穩(wěn)定性。

1.6 pH值測(cè)定

取絲瓜葉凝膠約1.0 g于20 mL蒸餾水中溶解，用pH計(jì)測(cè)量其酸度，測(cè)量3次，計(jì)算平均值。

1.7 抑菌活性研究

1.7.1 液體培養(yǎng)基的制備

精密稱取5 g/L酵母膏，10 g/L胰蛋白胨和10 g/L氯化鈉，加熱溶解，滴加適量NaOH溶液至pH值為7.4，過濾得到液體培養(yǎng)基，滅菌，備用。

1.7.2 倍比稀釋法測(cè)定抗菌活性

選用枯草芽孢桿菌（B.cereus）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌（E.coli），共 3 種供試菌種[12-14]。每種細(xì)菌取8支試管進(jìn)行編號(hào)，第1支試管為陰性對(duì)照，其中只加入1 mL的液體培養(yǎng)基，第2支試管為陽性對(duì)照，加入0.5 mL液體培養(yǎng)基和0.5 mL雙抗。第3支試管開始到第8支試管各加入1 mL液體培養(yǎng)基。取1 mL絲瓜葉凝膠溶液于第3支試管中，按照倍比稀釋法，混勻后從第3支試管吸取1 mL液體，加入第4支試管中。重復(fù)操作至最后一支試管，將絲瓜葉凝膠溶液配制成濃度不同的溶液。每組試管各加入一定濃度的試驗(yàn)菌液0.1 mL。恒溫培養(yǎng)24 h觀察比較試管的渾濁程度，記錄結(jié)果，重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.8 抗氧化活性測(cè)定

1.8.1 清除ABTS+自由基能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[15-16]，以維生素C（VC）作為陽性對(duì)照藥物。精密稱取0.040 6 g ABTS溶于水，定容到10 mL容量瓶中，同樣操作配制過硫酸鉀溶液?；旌吓浜玫膬煞N溶液，放置于黑暗環(huán)境中14 h。取適量無水乙醇稀釋至734 nm處的OD值為0.70±0.02，作為ABTS+自由基陽離子反應(yīng)液。

配制濃度為 1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的絲瓜葉凝膠溶液和對(duì)照品VC溶液，分別取75 μL不同濃度的絲瓜葉凝膠溶液加入96孔板中，后加入 75 μL ABTS+自由基反應(yīng)液，30℃反應(yīng) 6 min，每組平行設(shè)置3組，以水為基準(zhǔn)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定734 nm的吸光度，作為As。將各濃度提取物用水替代，測(cè)定734nm下的OD值，作為空白對(duì)照，記為Ac。平行測(cè)定3次，取平均值，按公式（1）計(jì)算ABTS+自由基清除率。VC按相同方法測(cè)ABTS+自由基清除率。

式中：As為絲瓜葉凝膠溶液的OD值；Ac為水的OD值（空白對(duì)照）。

1.8.2 清除DPPH自由基能力測(cè)試

參照文獻(xiàn)方法[17-18]，精密配制25mL濃度為0.1mmol/L的DPPH自由基溶液。配制濃度為1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 的絲瓜葉凝膠溶液和對(duì)照品VC溶液，分別取各不同濃度絲瓜葉凝膠溶液250 μL以及DPPH溶液250 μL，混合搖勻后，室溫（25℃）避光條件下反應(yīng)30 min，以甲醇溶液為基準(zhǔn)，平行設(shè)置3組，在517 nm處測(cè)定OD值記為Asample，取平均值；把待測(cè)絲瓜葉凝膠溶液換成純化水，加入DPPH溶液，混合搖勻后測(cè)定OD值記為Acontrol，再把DPPH溶液換成甲醇溶液，加入各系列濃度的待測(cè)絲瓜葉凝膠溶液，搖勻，平行設(shè)置3組，同樣方法測(cè)定OD值記為Asample blank，取平均值。以VC作陽性對(duì)照組，按公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：Asample為加入DPPH溶液后待測(cè)溶液絲瓜葉凝膠溶液的OD值；Acontrol為加入DPPH溶液后水的OD值；Asampleblank為加入甲醇溶液后各系列濃度的待測(cè)絲瓜葉凝膠溶液的OD值。

1.9 酪氨酸酶抑制活性研究

參照吳穎等[19]的方法，將絲瓜葉凝膠配成含總黃酮濃度為0.5、1、2 mg/mL的溶液作為待測(cè)物。向96孔板中依次加入50 μL磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）、50 μL酪氨酸酶溶液和50μL無水乙醇，30℃恒溫反應(yīng)10min，后加入50 μL的0.5 mg/mL左旋多巴搖勻，放置30℃下反應(yīng)5 min，用酶標(biāo)儀在475 nm進(jìn)行吸光度測(cè)定，作為A2；用待測(cè)物（各系列濃度的絲瓜葉凝膠溶液）50μL替代無水乙醇，按照上述方法測(cè)定吸光度，作為A1；分別按照上述方法對(duì)不加酶的待測(cè)液空白組和不含酪氨酸酶的溶劑空白組進(jìn)行吸光度測(cè)定，作為A3和A4。以熊果苷作為陽性對(duì)照，將其配成與待測(cè)物相同的系列濃度，按照下述公式（3）進(jìn)行酪氨酸酶抑制率測(cè)定[20-21]。

式中：A1為加入待測(cè)物的吸光度；A2為加入無水乙醇的吸光度；A3為不加酶的待測(cè)液空白組的吸光度；A4為不含酪氨酸酶的溶劑空白組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲瓜葉提取物的制備

50.0 g絲瓜葉經(jīng)榨汁、噴霧干燥得到淺綠色細(xì)粉末，噴霧干燥得率為22.79%。絲瓜葉外用凝膠劑成品為深綠色透明半固體物質(zhì)。

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 最大吸收試驗(yàn)

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、絲瓜葉凝膠溶液和空白凝膠溶液，在紫外可見分光光度計(jì)上掃描300 nm～700 nm波長。結(jié)果蘆丁在410 nm處有最大吸收峰，以確定在此范圍內(nèi)的最大吸收波長為410 nm，空白凝膠在此波長處無吸收，輔料無干擾。

2.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將顯色處理后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)分別于取上清液于410nm處測(cè)定OD值。以吸光度A對(duì)質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

如圖1所示，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=26.357 14x-0.008 36（R=0.999 74），可見蘆丁在 5 μg/mL～30 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，可精確測(cè)定絲瓜葉外用凝膠中黃酮的相對(duì)含量。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2.3 精密度試驗(yàn)

絲瓜葉凝膠溶液的吸光度基本一致，吸光度平均值0.434（RSD=0.58%），試驗(yàn)方法的精密度好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

6份絲瓜葉凝膠溶液的吸光度基本一致，吸光度平均值0.434（RSD=0.81%），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

絲瓜葉凝膠溶液在120 min內(nèi)吸光度基本一致，吸光度平均值0.432（RSD=0.52%），絲瓜葉凝膠溶液在2h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.6 回收率試驗(yàn)

絲瓜葉外用凝膠回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 絲瓜葉外用凝膠回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table2 Recovery results of external gelatin for loofah leaves（n=6）

如表2所示，平均回收率為99.09%，RSD=0.70%，符合分析要求，方法準(zhǔn)確度高。

2.2.7 含量測(cè)定

配制3批凝膠劑溶液，測(cè)定總黃酮的含量，絲瓜葉粉中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果見表3。

結(jié)果如表3所示，絲瓜葉粉中總黃酮含量為（0.57±0.02）%，即（5.7±0.2）mg/g，含量較高。黃酮具有很好的抗菌抗氧化抑制絡(luò)氨酸酶活性的功能，可以有效殺滅有害細(xì)菌，清除人體內(nèi)自由基且具美白功效。

表3 絲瓜葉粉中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of total flavonoids in loofah leaves powder

2.3 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

絲瓜葉外用凝膠經(jīng)過高溫、高濕、暴露空氣10 d，其質(zhì)量、外觀性狀、活性成分含量均無顯著變化。離心處理后所制備的凝膠未出現(xiàn)分層、變粗和沉淀等現(xiàn)象。絲瓜葉凝膠在極限的條件下無大的性質(zhì)變化，穩(wěn)定性好，符合要求。

2.4 pH值測(cè)定

絲瓜葉外用凝膠平均pH值為7.47，不會(huì)刺激給藥部位，符合中國藥典要求，可安全使用。

2.5 抑菌活性研究

絲瓜葉凝膠劑對(duì)3種菌株的抑制效果如表4所示。

表4 絲瓜葉外用凝膠對(duì)3種菌株的最低抑菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration（MIC）of loofah leaves external gel on 3 strains

由試驗(yàn)結(jié)果知，絲瓜葉凝膠劑的抑菌效果金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌，主要由于絲瓜葉凝膠對(duì)革蘭氏陽性菌敏感，因此對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果明顯?？莶菅挎邨U菌最低抑菌濃度為640 μg/mL絲瓜葉凝膠對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用較小，對(duì)大腸桿菌無抑菌效果。因此，絲瓜葉凝膠劑有一定的抑菌效果。

2.6 抗氧化活性測(cè)定

ABTS+自由基和DPPH自由基清除率試驗(yàn)見圖2。

清除ABTS+自由基能力測(cè)定結(jié)果如圖2A所示，絲瓜葉凝膠劑對(duì)ABTS+自由基清除效果明顯，與陽性對(duì)照VC相近，且清除率隨著抗氧化劑濃度的增大而增大，其半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）為20.12μg/mL，具有較強(qiáng)的清除ABTS+自由基抗氧化活性。

圖2 絲瓜葉外用凝膠在不同濃度條件下ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率Fig.2 ABTS+free radical scavenging rate and DPPH free radical scavenging rate of loofah leaves external gel under different concentration conditions

清除DPPH自由基能力測(cè)定結(jié)果如圖2B所示，測(cè)得其IC50為46.80 μg/mL。清除率隨著抗氧化劑濃度的增大而增大，當(dāng)濃度超過46.80 μg/mL后其清除率增加遲緩，不及陽性對(duì)照物VC。絲瓜葉凝膠具有一定的清除DPPH自由基抗氧化活性。

2.7 酪氨酸酶抑制活性研究

酪氨酸酶抑制試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 酪氨酸酶抑制試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of tyrosinase inhibition experiment

如圖3所示，絲瓜葉凝膠對(duì)酪氨酸酶抑制效果明顯，接近陽性對(duì)照組熊果苷，且隨著絲瓜葉凝膠濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí)其抑制效果可達(dá)到45.09%。因此，絲瓜葉凝膠可有效抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素的生成，具有美白的功效。

3 結(jié)論與討論

本研究采用榨汁提取-噴霧干燥法得到淺綠色絲瓜葉提取物粉末，以卡波姆940為主要基質(zhì)制備絲瓜葉凝膠。研究建立了紫外-可見分光光度法測(cè)定總黃酮含量，方法學(xué)研究表明本法具有良好的線性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性和回收率，可用于絲瓜葉凝膠中黃酮活性成分的測(cè)定?；钚匝芯拷Y(jié)果表明，絲瓜葉凝膠劑具有良好的抑菌、抗氧化、酪氨酸酶抑制活性。絲瓜葉外用凝膠劑對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果明顯，對(duì)ABTS+自由基及DPPH自由基均有較好的清除抗氧化效果，對(duì)酪氨酸酶具有明顯的抑制作用，其抑制效果與熊果苷相當(dāng)。研究制得質(zhì)地細(xì)膩、黏度適宜、涂展性好、高溫穩(wěn)定的親水性絲瓜葉凝膠，質(zhì)量穩(wěn)定可控，具有一定生物活性。較絲瓜葉片[22]、絲瓜葉固體飲料[23]、絲瓜葉膏有更好的應(yīng)用價(jià)值[24]，為絲瓜葉的進(jìn)一步開發(fā)提供參考依據(jù)。